采用UPLC-MS对国产EPO结构相似性评估以进行属性监测

2021-11-18 17:46:34, 沃特世沃特世科技（上海）有限公司

随着LC-MS技术的进步，治疗性蛋白表征的糖基化修饰分析研究领域已获得长足进展，这是生物类似药比较不可或缺的部分。重组治疗性蛋白的糖基化修饰因其在稳定性、体内活性、溶解性、血清半衰期和免疫原性方面发挥着重要作用被视为一种关键属性。

中国食品药品检定研究院采用超高效液相色谱质谱联用方法(UPLC-MS)，对中国两家生产商的两种市售rhEPO生物药物原料药进行了全面的比较分析，开发了一种能常规监测rhEPO产品糖基结构变化的有效工具，因为这些变化有可能导致rhEPO产品在免疫原性、半衰期和疗效方面的差异。研究成果已公开发表，证明所用UPLC-MS分析方法是一种可行工具，能够评估全球市场上不同市售rhEPO产品的差异，并重点关注了中国市场的相关需求。今天小编与大家一起研读学习。

图. 促红细胞生成素(EPO)的结构

rhEPO产品间的糖型整体特征比较

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图1. Intact mass analysis of rhEPO analogues by reversed-phase UPLC and ESI-MS for structural assessment（图A, B）。

图1A所示为两种rhEPO类似物的UPLC-MS谱图。如图1A中的单个宽峰所示，rhEPO样品的糖型特征似乎比较复杂。尽管未见rhEPO蛋白质异构体有明显的色谱分离，但进一步的检查表明，根据唾液酸（带负电荷的糖）数量和游离寡糖大小，采用UPLC时略微分离了EPO各糖型。当采用反相(RP)色谱技术或其他基于疏水性的技术时，rhEPO异构体的分离较难实现，因为这些异构体为结构相关的分子种类，各异构体间仅有细微差异。各种糖型的UPLC分离度总体欠缺，所以在完整蛋白质水平上的批量分析转而采用高分离度的MS技术。

图1B所示为两种rhEPO类似物（EPO A和EPO B）的原始质谱，所有色谱峰的MS扫描（范围为4.8-5.8 min）均有合并，并通过基线扣除进行了处理。有一系列代表多重质子化离子的谱峰，m/z范围为1500-2700。初看这些谱图似乎十分复杂，因为它们确实包含了大量的结构信息。谱图复杂性来源于两个主要因素：1.通常与电喷雾电离相关的多个电荷态；2.游离寡糖异质性。对于上述样品，电荷态的范围为12+ - 18+，并在谱图上进行了标记。

图2. Intact mass analysis of rhEPO analogues by reversed-phase UPLC and ESI-MS for structural assessment（图C, D, E）。

对于EPO A和EPO B样品，强度最高的电荷态均为15+和16+。如果检查单电荷态，则可观察到多个离子，表示rhEPO样品的不同糖型。去卷积质谱图显示在27,000和32,000 Da之间有许多谱峰，如图2C所示。一个rhEPO分子至多可以拥有14个唾液酸（每三个N-糖至多4个，每单个O-糖至多2个），部分游离寡糖的复杂性与这些分子的唾液酸化程度不同相关，唾液酸的数量在11-14之间。大多数这些离子都可能归为蛋白质骨架(18235.7 Da)，寡糖部分则与Hexn-HexNAcn-3-Fuc3-Neu5Ac11–14（n的范围为16-24）的总组成相对应。这些发现与相关报告一致，即rhEPO上的N-糖由岩藻糖基化的双天线、三天线和四天线复杂游离寡糖组成，唾液酸化程度较高，而O-糖具有Gal-GalNAc双糖核，末端具有一到二个唾液酸。为了推断在相邻峰簇上的游离寡糖归属情况，将相邻峰之间365 Da的质量差异归因为增加了Hex-HexNAc基团，相当于增加了一个臂或一个乳糖胺延伸结构；而656 Da的差异则归因为增加了一个臂或一个具有Neu5Ac末端的乳糖胺延伸结构。图2C中有大量代表rhEPO糖型的MS谱峰，还有许多MS峰簇。这些峰簇彼此相关，主要差异在于一个或两个单糖，或者其他修饰。

总体而言，整体谱图包括了若干个峰簇重复。图2D显示了主要离子和某些丰度较低的离子（谱峰处于一个簇中）。谱图该区域的基峰质量数与Hex22HexNAc19Fuc3Neu5Ac11的所有游离寡糖总的单糖组成相对应。研究推断，尽管还无法排除存在其他糖型与这种总组成相匹配，但是这种糖型可能含三个岩藻糖基化的四天线N-糖（无LacNAc连接）、一个O-糖和总共11个Neu5Ac单糖。主峰和位于+42 Da处的卫星峰表明某些唾液酸存在O-乙酰化。高于约16 Da质量数的小峰与主峰并未完全分离，这可归因为存在Neu5Gc或在蛋白质部分中存在蛋氨酸氧化（根据肽图分析数据，这种推断不太可能成立）。由于几乎所有峰都可能根据游离寡糖部分的质量数有对应归属，所以因蛋白质骨架修饰而造成的影响似乎微乎其微。

总体而言，谱图其他峰簇中MS峰的注释相似。原始和去卷积完整蛋白质量数分析数据显示，EPO A和EPO B的糖基化分布存在明显差异。与EPO A相比，EPO B样品显示的分子量分布更宽且高分子量分子更多。为了区分EPO B中存在更多高分子量分子是因为更多的唾液酸化作用，还是因为更高程度的支链化或更多延伸的N-糖结构，对两种rhEPO类似物均采用唾液酸苷酶进行了处理，以将唾液酸从N-糖和O-糖中去除。对去唾液酸化rhEPO样品进行完整蛋白质量数分析。结果表明，两种rhEPO类似物在去唾液酸化后的糖基分布十分相似，提示EPO B的更多高分子量分子是因为更高水平的唾液酸化所致。该结论还可通过游离寡糖数据得到印证，即本研究观察到EPO B中的高度唾液酸化结构比EPO A中的更多。这些结果表明该方法具有适用性，可对rhEPO样品的糖基化异质性进行总体表征，并可以尽可能少的样品处理来评价产品质量。

rhEPO产品间的O-糖型特征比较

因为O-糖是rhEPO整体糖型特征的一部分，所以有必要了解其模式以及rhEPO O-糖是如何导致EPO A和EPO B的整体差异的。采用PNGase F处理rhEPO样品去除N-糖，只留下O-糖结构作为与蛋白质连接的唯一游离寡糖后，对O-糖型进行了分析。图2E所示为EPO A和EPO B在N-糖基释放后的完整质谱。该图显示的信息十分详细，可以找出rhEPO的各个MS峰的归属。由于rhEPO分子在Ser126处仅有一个O-糖基化修饰位点，所以该特征显示在该位点存在O-糖基化修饰的微异质性。两个丰度最高的MS峰的去卷积质量数分别为18895.4 Da和19186.7 Da，与具有三糖(Hex-HexNAc-Neu5Ac)和四糖(Hex-HexNAc-Neu5Ac2)作为O-糖连接结构的N-糖基释放rhEPO一致。

原始数据显示：对于EPO A和EPO B而言，含两个唾液酸的O-糖型(EPO A：58.3%; EPO B: 55.9%)的丰度高于单唾液酸化糖型(EPO A：36.5%; EPO B：36.8%)，而且在O-糖上均有鉴定出唾液酸的O-乙酰化，即EPO A(O-糖的整体O-乙酰化：16.6%)和EPO B(O-糖的整体O-乙酰化：23.2%)。此外，对完整谱图的检查表明，存在与O-糖基化修饰（质量数18238.8 Da）相关的无糖基化rhEPO(1.6%和6.4%)。尽管在两种样品中均观察到18254.8 Da处（质量数高出16.0 Da）的峰，但是大多数峰似乎是PNGase F酶解期间蛋白质骨架氧化所致，而非存在Neu5Gc的缘故，这一点也通过游离N-糖分析实验得到了验证。

与测定游离寡糖和糖蛋白酶解物相比，完整糖蛋白的糖型测定具有诸多优势，例如节省时间和减少样品处理流程（操作人员和样品处理对结果的影响更小）。虽然这种方法可以提供质量属性的全面概览信息，但若查看更详细的信息，仍需要采用其他如基于肽图分析和游离寡糖分析的方法。这一点在Hex22HexNAc19Fuc3Neu5Ac11的总糖基组成上体现得十分明显。该组成的原因可能在于：有两个含Hex7HexNAc6Fuc1Neu5Ac3组成的N-糖；与牛津命名系统中的F(6)A4G(4)4S3相对应，有一个含Hex7HexNAc6Fuc1Neu5Ac4 (F(6)A4G(4)4S4)组成的N-糖，还有一个含Hex1HexNAc1S1组成的O-糖。或者，N-糖可能是Hex6HexNAc5Fuc1Neu5Ac3 (F(6)A3G(4)3S3)、Hex7HexNAc6Fuc1Neu5Ac3（可能为F(6)A3G(4)3Lac1S3）、Hex8HexNAc7Fuc1Neu5Ac4（最有可能为F(6)A4G(4)4Lac1S4），以及含Hex1HexNAc1S1组成的O-糖。第三种可能性是：含Hex5HexNAc4Fuc1Neu5Ac2 (F(6)A2G(4)2S2)组成的N-糖、两个含Hex8HexNAc7Fuc1Neu5Ac4 (F(6)A4G(4)4Lac1S4)组成的N-糖以及一个含Hex1HexNAc1S1组成的O-糖。所有这些可能性得到的总的单糖组成均相同。尽管如此，与第一种可能性相比，第二种可能性增加了乳糖胺延伸结构的量，同时减少了A4糖基的量；而第三种可能性虽然减少了A4糖基的量，但却增加了具有乳糖胺延伸的A4糖基的量。乳糖胺延伸可能是需要监测的重要关键质量属性，今后也可能是通过游离寡糖分析监测的可靠属性。与之相比，完整蛋白质量数分析方法则提供了有关完整rhEPO分子的高水平概览信息，能定性定量描述rhEPO多肽链上的所有PTM，但仍依赖于其他方法进行验证，从而强调了要获得全面可靠的表征需要进行多种实验。肽图分析数据表明，除了N-糖基化修饰和O-糖基化修饰外，在多肽骨架上不存在主要PTM。因此，通过完整蛋白质量数分析可能观察到的rhEPO整体蛋白质异构体或异质性主要归因于三个N-糖基化修饰位点和一个O-糖基化修饰位点处的糖基化修饰。

rhEPO肽图分析

EPO产品的主要氨基酸序列已通过UPLC-MS^E肽图分析实验进行了验证。除了氨基酸序列的确证以外，这些数据还可用于准确定位修饰位点（这无法通过完整蛋白质量数分析实现），这些修饰位点可能是由处理引入的，也可能是通过实验引入的，包括焦谷氨酸盐生成、蛋氨酸和色氨酸氧化、天冬酰胺脱酰胺和非特异性/非酶促糖基化。另外，如糖基化等生物PTM也可通过本方法进行分析。在本研究中，利用了MS^E的数据非依赖型采集方法。该方法为在低能量扫描(6 V)和高能量扫描（范围为20-45 V）之间交替，采集完整肽母离子数据及其碎片离子数据。由于未选择肽母离子，所以所有生成的离子均为碎片离子，从而得到的是有效且信息丰富的碎片离子数据（将至少三个碎片离子作为肽鉴定的标准）。由于这是一种“动态”方法，并未选择肽母离子，所以这种方法仍可定量，而且先前已经证明了其在肽图分析实验方面的助益。为了确保尽可能减少因共洗脱造成的不确定性，采用了扩展梯度，并得到了在基线分离的所有肽。通过扩展梯度实现的分离也使得对不同样品实施比较评估更加方便。

虽然许多肽图分析实验利用的是胰蛋白酶，但本研究采用的是赖氨酰肽链内切酶(Lys C)。内源性EPO的C端氨基酸残基为精氨酸，尽管研究报告rhEPO的生物药物产品没有该末端残基，但仍通过胰蛋白酶将其去除。因此，为了确保这些样品的末端没有精氨酸，赖氨酰肽链内切酶是一种更加合适的酶。赖氨酰肽链内切酶的酶解显示，含有蛋白C端的K9肽末端具有天冬氨酸残基。对于任何一种rhEPO样品，均未检出任何类似物的末端具有精氨酸。赖氨酰肽链内切酶产生了九种不同的肽，其已采用相关标准鉴定，被判定为有效肽（质量精度在预期值的2.5 ppm范围以内，且至少具有3个一级碎片离子）（参见图3）。

图3. LC-MSE chromatograms from the peptide mapping experiments of EPO A and EPO B digested by Lys-C. The assignment of each chromatographic peak is based on the accurate precursor mass measurement (<2.5 ppm) and the corresponding fragment ions generated in the high energy MSE data channel.

在两种样品中，发现了同样的九种肽。对于生物药物EPO，这九种肽的预期氨基酸序列的序列覆盖率为99%。仅有单个二肽（K8：LK氨基酸序列）未能鉴定。利用这些数据，对各种关键质量属性进行了研究，包括天冬酰胺脱酰胺、蛋氨酸和色氨酸氧化、N-糖基化修饰位点验证以及O-糖肽图分析。在rhEPO中存在六个天冬酰胺残基，其中三个(N24、N38和N83)为N-糖基化修饰位点，而且在任一样品的N24、N38和N83上均未鉴定出无糖基化位点。因此，仅有三个天冬酰胺(N36、N47和N147)可以自发脱酰胺，即不通过酶法去除N-糖。在20 h赖氨酰肽链内切酶/18 h PNGase F的协同酶解后，两种EPO样品的N47和N147处均观察到有自发脱酰胺，且每个位点自发脱酰胺水平非常相似。对于预期的肽序列和其脱酰胺类似物，生成了所有观察电荷态全部同位素的提取离子流图，并进行积分。随后，用脱酰胺物质的峰面积除以预期序列的峰面积。计算完成后，两种样品中N47的比率分别为3.8%和4.0%，N147的比率则分别为7.6%和8.3%。

研究认为，大多数的自发脱酰胺与酶解过程相关，因为两种样品在2 h赖氨酰肽链内切酶酶解后的N47比率均为0.4%，在4 h酶解后的比率均为0.7%。对于N47，两种样品在2 h酶解后的N47比率分别为0.5%和0.6%；对于N147，在4 h酶解后一种样品的比率为1.0%，另一种样品的比率则为1.2%。因此，很有可能天然蛋白质中的脱酰胺水平非常低，即对于N47和N147而言，比率分别小于0.4%和0.6%。在N36处，未见脱酰胺。对于rhEPO，仅存在单个蛋氨酸和三个色氨酸残基，其都有可能被氧化。再次创建并积分提取离子流图，将肽和氧化蛋氨酸的积分峰面积比率除以预期肽的峰面积比率。计算完成后，所得比率数值为12.6%。然而，由于蛋氨酸位于其中一个N-糖肽(N83)中，所以无法测定在2 h Lys C酶解或4 h酶解(2 h后添加PNGase F)后的数值，因为该肽在2 h PNGase F酶解后并无糖基释放。此外，该肽还含有两个无法氧化的色氨酸残基(W64和W68)，研究进一步观察到该肽具有一个或两个氧化水平较低的色氨酸残基。研究并未尝试测定色氨酸的氧化水平，因为其仅见于含有氧化蛋氨酸的肽骨架上。在W51处，未见色氨酸氧化。

N-糖分析

为了评估这项主要关键质量属性，采用了一种速度快、灵敏度高的方法对N-糖进行了分析。在该方法中，N-糖由于其糖胺仅在5 min内就可释放。接着，采用快速标记试剂(RapiFluor-MS)对氨基进行标记，研究显示，该试剂能提升FLR和MS的性能。随后，通过HILIC-UPLC/FLR-MS对标记N-糖进行分析，并借助UNIFI科学信息系统采用游离N-糖分析工作流程进行处理（FLR + MS确证）。虽然已根据欧洲药典EPO标准开发了用于RFMS标记游离寡糖的GU数据库，但是该蛋白质并不含有任何具备O-乙酰化唾液酸特征的游离寡糖。

因此，为了开展本研究，开发了一个自定义数据库。为了开发这个数据库，通过分析RFMS标记的葡聚糖校准曲线标准品，借助UNIFI计算了每个色谱峰的GU值。通过精确质量数数据和MS^E碎片离子数据，测定了每个峰的组成。因此，在许多情况下，游离寡糖以组成形式报告，原因是尚未测定唾液酸链，在某些情况下，多重O-乙酰化唾液酸的结构仍有不确定性。例如，含两个O-乙酰基的双唾液酸化游离寡糖可能在每个唾液酸上都含一个O-乙酰基，也可能在单个唾液酸上含两个O-乙酰基。尽管如此，在某些情况下，MS^E数据仍能显示更加确切的结构。例如，对于在m/z 1141.092处观察到的三电荷离子组成（图4），根据精确质量数数据，测定的初始组成为F(6)A3G(4)3S3/OAc2，这是含两个O-乙酰基（表示为“/OAc2”）的岩藻糖基化三天线/三唾液酸化游离寡糖，其中假定两个唾液酸为单O-乙酰化修饰。然而，MS^E数据检测表明组成为F(6)A3G(4)3S2SOAc(2)1，这种岩藻糖基化三天线/三唾液酸化游离寡糖的两个唾液酸并非O-乙酰化修饰，而是其中一个唾液酸为双O-乙酰化修饰。“OAc”后面的数字“(2)”表示单个唾液酸上的两个O-乙酰基。MS^E谱图在m/z 657.233处的高强度离子支持存在这一组成（参见插图图4），即Gal-GlcNAc-S碎片。假如具有两个单O-乙酰化游离寡糖，那么在m/z 699.244处应存在高强度离子，表明存在Gal-GlcNAc-S/OAc碎片。经观察，与该碎片对应的离子的离子强度非常低。尽管如此，在m/z 741.258处观察到强度很高的离子，而该离子与Gal-GlcNAc-SOAc(2)相关，其中两个O-乙酰基均与单个唾液酸连接。因此，从上述数据来看，我们认为该游离寡糖的组成应该为F(6)A3G(4)3S2SOAc(2)1。

图4. MS/MS spectrum for the triply-charged ion at m/z 1141.092, elucidating a probable glycan structure of F(6)A3G(4)3S3/OAc(2)1 for the ion. The inserted figure showing the intense ion m/z 657.233 supports the conclusion that the Gal-GlcNAc-S fragment bears two O-acetylation groups.

采用本分析工作流程，两种样品游离寡糖谱图的可比性非常高，如图4所示。第一种样品具有33个经质量数确认的游离寡糖，第二种样品则有32个经质量数确认的游离寡糖。关于质量数确认，要求实测质量数在计算质量数的5 ppm范围以内。对于这两种样品，最主要的游离寡糖为F(6)A4G(4)4S4，其他丰度更高的游离寡糖为具有1~3个乳糖胺延伸和3或4个唾液酸的四天线（在本研究所用命名中以A4表示）结构。在本研究中，仅观察到具有N-乙酰神经氨酸末端的游离寡糖，未检出含N-羟乙酰神经氨酸的游离寡糖。对于这两种样品，所有经质量数确认的游离寡糖均存在岩藻糖基化和唾液酸化的情况。

图5. Annotated fluorescence (FLR) chromatograms from the HILIC-UPLC/FLR-MS analysis of rhEPO analogues, depicting the N-linked glycans derived from the EPO A (top) and EPO B (bottom). In total, 33 glycans were mass confirmed for EPO A and 32 glycans for EPO B.

在rhEPO中有多种重要的N-糖属性需要监测，包括游离寡糖高度支链化（A4型）的程度、具有乳糖胺延伸的游离寡糖含量以及含O-乙酰化唾液酸的N-糖水平。为了比较每种属性的水平，对体现相应属性特征的每种游离寡糖含量百分比进行了汇总。如图5中的汇总情况所示，EPO A的A4游离寡糖水平略低于EPO B，分别为65%和近74%。若仅考虑具有乳糖胺延伸的A4游离寡糖，则EPO A（约31%）的这类游离寡糖含量百分比仍会略低于EPO B (37%)。对A4游离寡糖和具有乳糖胺延伸的游离寡糖水平进行监测具有重要意义，因为这两类游离寡糖可增加该蛋白质的稳定性并影响其血清半衰期。

对于rhEPO而言，需要监测的一项重要N-糖特征是唾液酸的O-乙酰化水平。O-乙酰化会阻断唾液酸酶活性，防止去除该单糖并延长EPO的血清半衰期。EPO A具有18个含O-乙酰化唾液酸的N-糖，EPO B中则发现了16个这类游离寡糖。若对含O-乙酰化唾液酸的每种游离寡糖含量百分比进行汇总，则第一种样品的O-乙酰化唾液酸水平为21.8%（图5），第二种样品的水平为16.1%。对于这两种样品，丰度最高的含O-乙酰化唾液酸的游离寡糖为F(6)A4G(4)S3SOAc1，经测定，两种样品中该游离寡糖的含量百分比不足6%。

图6. Abundance levels of various N-glycan attributes. The values were calculated by summing the normalized abundance levels (see Supplemental Table III for details) for each glycan that possesses a given attribute. The percentage of O-acetylation refers only to N-glycans.

结论

本研究利用几种互补的分析工具对中国生产的rhEPO产品分子结构进行了表征。上述分析的合并结果提供了关于rhEPO分子的深度结构信息，从而使对中国市场上的rhEPO产品开展结构相似性评估成为可能。对于可能出现在rhEPO肽骨架上的潜在PTM（非N-糖基化修饰），肽图分析数据提供了相关的详细信息；然而，对于在rhEPO上的关键PTM（N-糖基化修饰），肽图分析方法尚未涵盖，游离N-糖分析则提供了相关的补充信息。通过肽图分析方法和游离N-糖分析获得的信息又有助于更好地理解/解释完整蛋白质量数分析数据，这提供了有关分子异质性的全貌。
本研究的主要部分重点关注了EPO类似物的游离寡糖分析，因为糖基化修饰对所观察到的结构差异有很大影响。对于游离糖基分析，采用了一种集成工作流程，该流程结合了新近报告的RFMS游离寡糖标记试剂和预先构建的归一化HILIC-UPLC保留时间游离寡糖数据库，前者可提升游离寡糖的UPLC-MS分析性能，后者可自动化完成糖基鉴别并获得准确的MS数据，以供进行质量数确认。该分析工作流程的核心是游离寡糖数据库。主库开发采用通过严格结构表征研究获得的真实实验数据，相关研究借助了外切糖苷酶阵列酶解和精确质量数测定技术。辅库开发针对的是含O-乙酰化唾液酸的游离寡糖，并以精确质量数作为基础，因为唾液酸O-乙酰化可抑制唾液酸酶活性，所以这类游离寡糖能耐受进一步的外切糖苷酶阵列酶解。本信息学工作流程提供的方法可鉴定复杂混合物中单个游离寡糖，并可借助FLR数据定量比较不同样品的游离寡糖谱图。因此，本分析工作流程可用于监测上市以及尚在开发的rhEPO产品的产品质量属性是否发生变化。这一能力通过本研究所分析的两种不同样品得到了充分体现。
本研究所用方法显示两种样品具有几点共性：两种样品中的游离寡糖均高度唾液酸化、大多数唾液酸均呈O-乙酰化结构，而且两种样品中的几种N-糖天线均具有N-乙酰乳糖胺单元延伸。同样重要的是，本方法可以显示某些关键结构差异。例如，EPO A的A4游离寡糖水平(65%)略低于EPO B（近74%）。若仅考虑具有乳糖胺延伸的A4游离寡糖，则EPO A（约31%）的这类游离寡糖含量百分比仍会略低于EPO B (37%)。这些数据突出了对生物药物中糖基化修饰监测的必要性，特别是对于身处生物类似药时代的人们，糖基化修饰监测可有力确保持续的安全性和疗效。已有报告指出，通过CHO细胞生产的生物治疗药物糖蛋白可能携带少量潜在有害的游离寡糖表位，如N-羟乙酰神经氨酸，其会引起人体内的非预期免疫原应答。采用本研究所述的这类方法对新开发的和现有rhEPO产品的糖基化修饰进行密切监测，将为此类产品的安全性和疗效提供可靠保证。

参考文献

William Alley Jr , Lei Tao , Henry Shion , Ying Qing Yu , Chunming Rao , Weibin Chen. UPLC-MS assessment on the structural similarity of recombinant human erythropoietin (rhEPO) analogues from manufacturers in China for attribute monitoring. Talanta. 2020 Dec 1;220:121335.