成像前沿丨活体动物树突棘成像

本文作者：北京大学深圳研究院  Dr. 张飞龙 

      什么是树突棘？    

神经细胞主要有三大部分组成：树突(Dendrite)、轴突(Axon)和胞体(Soma)。树突分枝上的棘状突起被称为树突棘(Spine)，其结构微小，长0.5~1.0微米，粗0.5~2.0微米；但却是突触形成的重要组成部分，能够接收其他细胞的信号输入，并传送到胞体。

成熟树突棘参与95%以上兴奋性突触的组成。其末端膨大呈球状，通过一个狭窄的颈部与树突干相连，形成一个突触后生化区室；从而使得突触间隙与树突干隔开，允许每个树突棘行使局部独立的功能。

图1：神经细胞结构组成

https://qbi.uq.edu.au/brain/brain-anatomy/what-neuron

在我们的大脑中，数以亿计的神经元之间正是通过这种轴突-树突棘的连接方式形成突触，进行信息的传递，整合和储存。脑科学中一个重要的目标是理解这一过程是如何发生的。自从Cajal在19世纪末期首次使用高尔基染色描述了树突棘后，越来越多的体外实验结果逐渐为我们部分揭示了树突棘在学习记忆中的变化和作用机制。

而在这些研究进展的背后，显微镜技术和神经元可视化荧光蛋白的发展功不可没。

       双光子活体成像       

尽管这些基于离体组织切片或者培养细胞的工作为我们提供了树突棘形态发育和功能的最初视角，但是在活体大脑内树突棘的实际情况是否与体外实验一致，还不得而知。

Denk和Webb在1990年发明了双光子显微镜技术[1]，结合表达荧光蛋白的转基因小鼠[2]，使得科学研究者可以在活体状况下对小鼠脑组织进行深度成像[3]。

   简单来说，双光子显微镜的基本原理是基于两个光子几乎同时被吸收（大约10^-18s）这一设想。这种光源的特性使得双光子显微镜相比单光子共聚焦显微镜在活体成像方面有着显著的优势。

图2：单光子与双光子激发效果对比图

一方面，双光子显微镜在对组织成像时，激发光仅仅落在数微米范围的区域内，这样对成像组织的损伤和毒性比较低，对荧光蛋白的光漂白作用也很小，同时提高了信噪比。

另一方面，常规荧光的激发根据波长的线性依赖性，双光子则与之不同，其使用波段更长、组织穿透性更好的红外光源激发，主要依赖于激光强度去激发样品；并且一般使用飞秒脉冲激光器，波段纯净，峰值光子密度极高，因此同一激发波段时又进一步增加穿透能力，即成像深度。

上述两方面的优势对于在活体小鼠上长时间研究不同大脑深度的树突棘至关重要。

       双光子显微镜在活体动物 

 树突棘成像方面的应用     

从2000年以来，应用双光子显微镜技术和针对不同分子的荧光蛋白小鼠和病毒，科学家们在活体动物的树突棘研究上取得一系列重要进展。下面，我们就双光子显微镜在树突棘结构成像和钙成像方面的应用举例。

      1.活体动物树突棘结构成像    

     图3显示的是在表达黄色荧光蛋白（YFP）的转基因小鼠上进行长期双光子成像。其方法是通过磨薄需要成像脑区的颅骨，在尽可能不影响成像区域微环境的前提下，对皮层椎体神经元的树突棘进行多天的成像。利用这样的方法，我们可以对一些有趣的问题进行研究。例如在学习过程中我们的大脑是怎么变化的？环境的变化是否会影响我们的大脑？

图3 表达黄色荧光蛋白(YFP)转基因小鼠长期双光子成像[3]

（a）YFP-H系小鼠的冠状切片，其显示在桶状皮层第五层的锥体细胞中表达YFP荧光蛋白。第五层细胞的树突最终投射到第一层，可以用双光子显微镜成像。(b) 小鼠的双光子成像示意图。（c）小鼠颅骨磨薄的背视图。将要成像的皮质区域上方 (200μm直径的区域内) 的颅骨变薄至约20μm。插图显示了方形内的血管系统，可以用作相同神经元结构的重复成像的标记。（d）树突结构成像的三维重建。插图显示了重建的成像叠层的侧视图。星号表示变薄的颅骨，厚度约20μm。（e，f）树突和轴突结构的高倍放大图像。间隔三天，成像位置可以随时间在同一动物准确再现。

    在图4所示的研究中我们可以利用双光子成像技术回答这些问题。当小鼠通过转棒仪跑步训练两天后或者将小鼠从日常的生活环境中（standard housing environment(SE)）转移到新的具有丰富信息的环境中（enriched environment (EE)）后，小鼠相关皮层神经元都有更多的树突棘形成(多5-7%左右)。这意味着运动学习和新的环境会带来新的突触连接的形成，小鼠有了新的记忆[4]。

图4  运动学习和新颖的感官体验促进树突棘的形成[4]。

（a）树突棘在转棒仪训练或感觉增强之前和之后的双光子成像。（b）运动皮层的脉管系统视图。（c）b方框区域树突的双光子图像。（d，e）对同一树突在转棒训练前后的重复成像。箭头表示在两天内形成了新的树突棘。（f）与未经训练的小鼠比，转棒训练组小鼠的树突上形成了更多的新树突棘，而且年轻小鼠比成年小鼠的运动皮层有更高的形成率。（g）在EE环境下，幼年和成年动物的桶形皮层两天内会形成更多的新树突棘。修剪掉胡须后，在EE环境下未发现树突棘形成的增加。

     双光子显微镜在树突棘结构成像方面的应用，除了对树突棘本身的形态进行成像以外，还可以结合一些新的、针对某些特定分子的荧光蛋白指示剂研究树突棘变化背后的分子机制。

继续以运动皮层为例，图5显示运动学习会引起运动皮层神经元形成新的树突棘，建立新的连接。实际上，除了建立新的连接，运动学习也会对大脑已有连接进行调节，增强已有的树突棘。那么从分子层面，哪些蛋白参与了树突棘的变化？

Richard L. Huganir 实验室最近的一项研究使用荧光标记的AMPA受体的体内双光子成像部分回答了这一问题。

他们通过对学习过程中AMPA受体在时间和空间上的动态变化进行追踪，发现在对小鼠前肢抓取食物运动训练后，随着小鼠抓取技能的提升，运动皮层第5层神经元的树突棘和树突棘上AMPAR亚基GluA1表达水平增加。这一结果表明，运动学习通过增加AMPAR进入树突棘的净运输量来诱导广泛的皮层突触增强[5]。

图5 重复的运动学习会导致树突棘内GluA1水平升高[5]。

（a）运动皮质中表达SEP-GluA1（绿色）、myc-GluA2和dsRed（洋红色）的稀疏标记的第5层神经元。（b）在训练过程中，对照组小鼠（暴露于训练室内但未被训练）的第5层神经元树突棘的重复成像。（c）在训练期间，受过训练的小鼠第5层神经元树突棘的重复成像。箭头指示脊柱的SEPGluA1信号强度逐渐增加。（d，e）在运动学习过程中，经过训练的（蓝色）和对照（灰色）小鼠的树突棘的GluA1强度和树突棘大小的变化。

      2.活体动物树突棘钙成像      

双光子显微镜在树突棘钙成像的应用最主要得益于基因编码的钙信号指示剂研究的发展——GCaMP3和GCaMP6的出现。

其中GCaMP6 是由 Tsai-Wen Chen, Trevor J. Wardill等在 2013 年开发出来的一种超灵敏的钙离子信号指示剂。得益于GCaMP6 相对于 GCaMP3 和 GCaMP5 在各个方面都有巨大的提升。例如 GCaMP6s对一个动作电位刺激的反应的荧光值峰值是GCaMP3 的十倍左右，而且它的信噪比也提升十倍左右，灵敏度有了大幅度提升[6]。现阶段GCaMP6已经成为研究树突棘钙成像的主要工具。

    近年来双光子显微镜钙成像已经成为神经科学领域的一项热门技术，大量文献和研究层出不穷。因此本文不再具体探讨双光子显微镜钙成像在某一科学问题中的应用实践。仅通过小鼠运动皮层树突棘的钙成像视频展示小鼠在不同的时期（休息，运动，睡眠的慢波睡眠和快速眼动睡眠时）树突棘的钙离子活动。

视频1：对小鼠第五层椎体神经元在休息和运动（上），慢波睡眠和快速眼动睡眠（下）时树突棘钙离子活动重复成像（视频使用Olympus FV1000MPE采集，Image Size 512*512，ZOOM*3）

     3. 活体动物树突棘结构和钙信号同时成像   

    然而在研究具体的科学问题时，我们往往希望同时对树突棘的结构和钙信号同时成像，也就是将双光子结构成像和钙成像技术结合起来。

为了实现这一功能，我们可以将标记结构的tdTomato红色荧光蛋白和标记钙离子的GCaMP6绿色荧光蛋白同时通过病毒或者质粒的胚胎电转技术注射到需要研究的相关脑区，当两种蛋白同时感染同一神经元时，就可以在双光子显微镜下进行双色成像。

视频2：小鼠在运动时对第五层椎体神经元树突棘双色成像.

（视频使用Olympus FV1000MPE采集，Image Size 512*512，ZOOM*3）

    总的来说，双光子显微镜的活体成像是研究树突棘可塑性的最主要工具之一。

随着我们对树突棘的了解越来越深入，现有的双子显微镜成像技术也需要更进一步的发展。比如，需要扫描速度更加快速同时不牺牲成像质量的新显微镜，这可以帮助我们在毫秒级别乃至更快的时间窗口上理解树突棘活动；需要能更好进行3D 扫描或者更多光子激发的活体动物成像显微镜，两者都可以在空间上拓展我们对树突棘的理解。而这些技术的进步也必将推进人类对大脑未知奥秘的探索。 

参考文献：

1.Denk, W., J. Strickler, and W. Webb, Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science, 1990. 248(4951): p. 73-76.

2.Feng, G., et al., Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron, 2000. 28(1): p. 41-51.

3.Bhatt, D.H., S. Zhang, and W.B. Gan, Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol, 2009. 71: p. 261-82.

4.Yang, G., F. Pan, and W.B. Gan, Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature, 2009. 462(7275): p. 920-4.

5.Roth, R.H., et al., Cortical Synaptic AMPA Receptor Plasticity during Motor Learning. Neuron, 2020. 105(5): p. 895-908.e5.

6.Chen, T.-W., et al., Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature, 2013. 499(7458): p. 295-300.