直播 Q&A丨3D类器官与活体动态深层成像

我们近期的直播课《3D类器官与活体动态深层成像》反响热烈，（戳这看→ 直播回放丨3D类器官与活体动态深层成像） 直播期间老师们频频举手提问，很遗憾因时间关系未能一一作答。

对此，明星小编团特意整理了高频问题 Q&A，按 样品制备、应用范围、技术原理、仪器选择 分为4个篇章，每部分精选5个问题回答，供各位老师参考指正。

样品制备篇 

Q：长达数月的小鼠大脑采集，如何保证每次拍摄同一个视野呢？一直保持着小鼠固定在显微镜载物台上吗？

A： 不不不，小鼠每天都回家吃饭呢！

通常小鼠只有在成像的时候才需要固定在载物台上。借助专用的小鼠固定装置，结合大脑解剖学，可以快速定位到特定脑区。在该脑区里，以脑血管的形态作为参照坐标，即可找回同一个视野。脑血管是一个比较稳定的参照物，即使不染色，血管双光子图像形如黑色管道，很容易辨认。当然，这样的操作离不开仔细观察和反复练习。

感兴趣的老师可参考管吉松老师课题组的文章，他们已经成功地对同一只小鼠成功实现连续两个月的脑成像（Xie Hong et al. PNAS. 2014）。

Q：活体双光子给小鼠制备的颅窗，在饲养十天后会模糊吗？长出“骨膜”之类的？

A：如果是“开窗法”制备小鼠颅窗，建议用镊子撕掉硬脑膜，重新长出来的硬脑膜大多数透明，不影响双光子成像，个别情况下因炎症出现白色或肉色的增生物质，颅窗就不能长期使用了。一般开窗半年的小鼠仍然可以做活体双光子实验，取决于开窗手术的精细度。

Q：小鼠如果在运动，如何保证拍摄视野的稳定？我们拍照时麻醉后呼吸影响拍到的照片总有拖影。

A： 小鼠的呼吸心跳或运动很容易导致图像抖动的问题，解决这个问题有几个思路。

首先，选择合适的固定器稳定标本，如脑成像通过机械固定比较多，而脏器软组织成像大多使用负压固定系统等。固定器的调节也并非一步到位，需要通过摸索，找到最稳定的点。

其次，在不影响数据收集的前提下，尽量提高拍照速度调节双光子拍照频率，使其与呼吸心跳节奏一致。

最后，不同帧图像因抖动产生的位移可以借助软件解决，如Image J插件Running Z Projector等。

Q：如何在活体某个部位进行荧光标记？染色方法和共聚焦一样吗？

A： 如果是培养细胞样品标记和共聚焦区别不大，主要考虑荧光激发发射的差别。如果是活体样品则有转基因荧光，病毒标记，免疫荧光标记，小分子探针直接标记等方法。

例如，血管标记可以把染料通过尾部静脉注射直接标记；大脑神经细胞大多是慢病毒介导的荧光转基因方法标记；免疫细胞可在体外使用荧光抗体标记后，再把带着荧光的免疫细胞通过腹腔注射回小鼠体内。

Q：双光子看肿瘤细胞进血管，血管如何显色？另外血流红细胞怎么看的？

A：观察血管，一种方法是通过染料填充血管，可以使用Dextran/Texas Red/70,000 MW（Invitrogen公司）或Rhodamine B isothiocyanate-Dextran（Sigma公司）等荧光染料直接尾静脉注射。请注意，要选择分子量较大的Dextran，避免染料进入血管后渗透弥散。另一种方法是可以用荧光标记的CD31单抗，标记血管内皮细胞，显示出血管的轮廓。

应用范围篇

Q：无标记成像的适用范围是什么呢？

A： 双光子无标记成像有几类不同的技术，使用较多的是二次谐波（Second Harmonic Generation，SHG）。SHG信号只在有周期结构而非中心对称的介质中观察到，如骨骼、皮肤、角膜等富含胶原蛋白、微管结构的组织中广泛存在。在SHG现象中，实际观察时就会看到发射光波长是入射光波长的一半（频率增加一倍）。

另一种新型无标记成像技术是受激拉曼散射成像（stimulated Raman scattering microscopy，SRS），可根据分子化学振动频率的特异性，检测脂质、蛋白质、核酸、木质素等多种物质，目前在细胞生物学、肿瘤研究、神经科学、药代动力学、转换医学、植物学等多个领域均有应用。对此感兴趣的老师可以阅读我们往期关于SRS应用文章（戳这里阅读→ 受激拉曼散射显微成像：无标记生物成像新方法）。

Q：双光子能看到小鼠活体大脑海马区吗？

A： 可以的！海马区位于较深的脑区，对双光子成像是一个极大挑战。深脑标记建议优先考虑波长较长的荧光蛋白或染料，如红色荧光在组织中的穿透力相对更高。

目前我们用户成功实现海马成像有两种方法：

一种是挖皮层埋套管，配合4mm双光子水镜成像，优点是通过手术把海马区从“深脑区”变成“浅脑区”，分辨率高，突触等精细结构也能看清；缺点是手术难度大，损伤皮层，视窗小。

另一种方法无需损伤皮层，而把双光子系统的性能发挥到极致——配合4mm工作距离双光子物镜，通过Deep Focus Mode深焦模式收窄激光，进而集中激发能量，激活深脑荧光。

感兴趣的老师可以参考Masashi Kondo et al., eLife, 2017，欣赏小鼠海马钙动态变化吧！

Q：我们考虑做树鼩双光子成像，您有什么建议吗？

A： 树鼩是一种比较特殊的双光子成像模式动物，目前我们接触的用户多以树鼩作为更高等的哺乳动物研究大脑神经。保证双光子的几大要素对树鼩成像都很重要——特异性标记，固定样品，尽量暴露目标样品，使目标位置满足双光子物镜工作距离，并且保证活体生命力。此外，树鼩相对小鼠体型较大，配合旋转物镜进行成像会更加方便哦！

Q：倒置的双光子显微镜，有哪些应用？操作上注意什么？

A： 倒置双光子显微镜主要是细胞层面上的研究，如在纳米领域，双光子荧光探针领域，以及与双光子相结合的细胞通路相关实验。也适用于一些软组织的活体观察，如肾脏、肝脏、肠、淋巴结、肿瘤等，以及3D类器官、细胞微球等标本，用倒置双光子成像相对更方便。

Q：如何用双光子看类器官？

A：类器官属于三维细胞培养物，保证荧光标记物的特异性以及样品的固定，可以进行常规实验操作。建议选择具备红外校正的硅油介质的物镜观察类器官，因为硅油的折射率（ne≈1.40）接近于活细胞组织的折射率(ne≈1.38），比水镜更好解决因折射率不匹配带来的球差问题，从而提高了图像分辨率和类器官的观察深度。而且红外校正能力的物镜可以提高双光子激发效率。

技术原理篇

Q：深焦模式下，把激光光斑收窄后能量变强，对脑组织伤害不会更大吗？

A： 不会，激光总功率不变，又是点扫描成像，不会一直照在同一个位置，而且双光子只在焦点激发，整体光毒性比较小。常规扫描模式下10-30mW的平均激光强度，可以有效避免活体脑成像光毒性问题。

激光光斑收窄后最大影响不是光毒性，而是分辨率的损失（物镜数值孔径不能被充分利用）。深度和分辨率，就像鱼与熊掌，难以兼得。如果使用新型TruResolution全自动球差校正物镜，通过折射率匹配，可以很好地调和这个矛盾哦！

Q：光毒性比较小是因为考虑红外波长生物窗口吗？那双光子光功率对光毒性的影响呢？

A： 双光子成像光毒性小的主要原因是红外光组织吸收少，穿透力强，且只在焦点起作用。与其他光学设备类似，双光子也是激发光功率越大，光毒性越大，对标本造成的损伤也越大。通常情况下双光子更需要考虑的不良影响是热损伤，而非光毒性。

Q：双光子成像所用的染料所对应的波长一定是单光子的2倍吗？有没有特定的对应数据？

A： 不一定，双光子波长选择并不像单光子那样是线性的规律变化，双光子中不同波长对应的激光功率也不一样，一般建议单光子波长的2倍加减20nm波长范围内去摸条件。条件允许下，可全波长范围内摸索条件来确定最适合的双光子激发波长。

Q：只有一个飞秒激光器的情况下，如何减少双光子显微镜多色成像中的串色问题？

A： 在只有一个激光器的情况下，双光子多色成像串色问题较难避免，因为双光子激发范围比单光子要更宽，往往一个激发波长可以同时激发不同荧光，而同时被激发的荧光一旦出现串扰，即使通过光谱拆分也不一定很精准区分。

对此，更为可靠的方法是合理选择荧光组合，如通过选择发射范围相差较大的染料对，尽量减少overlap。在条件允许的情况下，使用双谱线或双激光有助于改善串色问题。

Q：二次谐波SHG用什么收集信号？

A： 二次谐波信号直接使用双光子的检测器就可以检测到。收集信号时有两点需要考虑，一是SHG发射波长特异性非常高，是激发波长的一半，需要选择合适的滤片；二是SHG信号具有方向性，前向信号和背向信号分别需要透射和反射检测器采集，如果对SHG信号要求不高，标准反射检测器即可满足要求。

仪器选择篇

Q：共聚焦不是可以和双光子搭配吗？怎么光路完全不一样了？

A： 因为共聚焦和双光子原理不同，使用的光源、检测器、物镜类型等最核心的光学部件也不一样，因此即使搭配在一起，也是完全不同的两套光路。如共聚焦大多使用连续可见光激光（405-640nm），而双光子必需超快脉冲红外激光光源（690-1300nm）。

又如共聚焦检测器必需通过针孔成像，借助针孔过滤非焦平面信号，而双光子只在焦点激发，无需针孔无需二次扫描，使用光路最短的 NDD检测器（Non-Descanned Detector）。

此外，因为两个设备应用方向不同，机架选择也有差别，共聚焦常搭建于倒置显微镜用于观察活细胞成像，而双光子常搭建于正置显微镜用于活体成像。

Q：共聚焦与双光子对物镜分别有什么要求？如何选型。

A： 共聚焦与双光子对物镜要求区别：

1）校正波长不同，双光子物镜对近红外透过率校正要求很高，而共聚焦物镜以可见光为主；

2）工作介质不同，双光子借助水镜更好兼容活体标本，共聚焦多用干镜和油镜；

3）工作距离不同，双光子物镜工作距离通常要更长，更好支持活体深度成像；

从数量上，共聚焦从1.25x-150x配置多个不同倍率的物镜，而双光子大部分情况下会选择兼顾了NA值和工作距离的25X双光子专用水浸物镜。

Q：能具体讲解一下双光子不同镜头的应用吗？

A： 双光子最常用的25X水镜，工作距离2mm，可满足常规活体成像实验需求，还有工作距离分别为4mm和8mm的特殊物镜，可满足更深区域的拍摄需求，并支持不同折射率标本，兼容透明化标本深度三维成像。

选择双光子物镜时，需要根据标本特点和应用要求，从工作距离（影响检测深度）、数值孔径（影响分辨率）和折射率（影响球差校正）综合选择。如要对深层信号进行高清成像，还可以考虑新型TruResolution全自动球差校正物镜。

Q：请问双光子能取代激光共聚焦显微镜观察细胞器吗？

A： 双光子也可用于观察活体细胞器，但不能完全取代激光扫描共聚焦显微镜。一是共聚焦成像分辨率更有优势，二是共聚焦更适合多色成像，而双光子通常一个激发光很可能激发多个荧光而导致串色。

此外，还要综合实验体系进行考量，如果在培养细胞里观察细胞器，共聚焦配合倒置显微镜操作更方便，如果需要在活体或有一定厚度的活组织里观察，则双光子配合正置显微镜更适合。

Q：请问双光子显微镜对操作人员的技术水平要求高吗？使用过程中是否有技术难点？

A： 双光子拍摄大概分4步：样品处理，样品固定，仪器操作，图像处理。

较难的是样品处理和固定，要尽量暴露样品同时保证活体尽可能少抖动，而仪器操作相对简单，经过培训一般可独立操作。特别是新型双光子显微镜对非光学背景的用户而言操作简单友好，如激光四轴自动校准等设计，使用人员无需掌握复杂操作和维护，只需在软件上一键

为了准备这次的Q&A，小编把压箱底的货都拿出来分享啦！ 

还想了解更多关于双光子的应用知识吗？请

本期明星小编团：WangZW, YSL, ShellringQi

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