恒光讲堂｜用于前列腺癌光热治疗的具有AIE特性的超均质NIR-II荧光自组装纳米探针

2021-11-01 18:56:11, 恒光智影上海恒光智影医疗科技有限公司

本文要点：近红外二区（NIR-II）荧光成像作为一种提供厘米级深度和微米级分辨率的无创成像技术，已引起人们的关注。然而，在兼顾体内代谢的同时，制备出具有均匀尺寸、高生物等效能力和荧光强度的NIR-II荧光纳米探针仍然是一个挑战。本文中作者使用DSPE-PEG封装具有AIE性质的二区荧光分子构建出了一种具有优异水溶性和生物安全性的超均质NIR-II荧光纳米探针。该纳米探针具有高效的热转换效率和优秀的热稳定性，作者应用其进行NIR-II荧光成像，发现该纳米探针可以在体内有效代谢并在前列腺癌肿瘤组织中有效聚集，应用激光介导的光热疗法治疗前列腺癌肿瘤时可以显著抑制肿瘤组织的生长。此外，由于快速代谢，探针在体内的滞留减少，有利于该探针的进一步临床应用。最终，作者认为该纳米探针在前列腺癌的准确诊断和治疗方面具有广泛的临床应用潜力。

该纳米荧光探针是一种新的基于NDI的NIR-II荧光纳米探针，设计和制备示意图如下（图1）。

图1：NIR-II纳米探针的设计和制备示意图。

为了制备具有良好水溶性和生物相容性的NIR-II荧光分子，作者使用DSPE-PEG对荧光分子进行封装，以制备NIR-II纳米探针。如透射电子显微镜图所示（图2c），在DSPE-PEG封装后，获得了NIR-II荧光纳米探针（直径：138.6±6.2 nm）。此外，NIR-II荧光分子以聚集的形式封装在DSPE-PEG中，如冷冻电子显微镜图所示（图2d）。NIR-II纳米探针的紫外-可见吸收光谱显示在400–700 nm吸收带处最大吸收波长为575nm（图2e）。NIR-II分子的荧光发射光谱显示，在THF溶液中在808nm激光激发下，发射波长峰值为1060nm（图2f）。接下来，作者通过改变四氢呋喃（THF）/水混合物中的水分数（f w），研究了聚集状态下基于NDI的NIR-II分子5的发射特性（图2g）。随着向THF中逐渐添加水，荧光强度降低，直到f w =48%，这可能是由于溶剂极性效应和由此产生的TICT状态转变。f w从48%增加到96%荧光发射强度逐渐增加，显示出典型的AIE特征。AIE活性分子允许有效的固体/聚集发射（图2h），这对生物医学成像有用。为了检测制备的纳米探针的热生产能力，作者使用近红外热成像来监测探针在633nm激光照射下的热转换效率。在连续633nm辐射下，纳米探针的温度持续升高，240 s后达到60℃，而在类似条件下，去离子水的温度仅达到38℃，表明纳米探针具有高效的热转换效率（图2i）。

图2：（a）基于NDI的NIR-II分子5的合成步骤和（b）MALDI-TOF-MS。（c）磷钨酸负染NIR-II纳米探针的TEM显微照片。（d）纳米探针的冷冻TEM显微照片。（e）NIR-II纳米探针在去离子水中的紫外-可见吸收光谱。I：NIR-II分子，II：纳米探针。（f）纯THF中NIR-II纳米探针的荧光发射光谱。（g）NIR-II纳米探针在不同水组分（f w）的THF/H2O混合物中的光致发光（PL）光谱。（h）NIR-II纳米探针的PL峰值强度与THF/水混合物的fw的关系图。I0和I分别是纯THF（fw=0）和具有特定fws的THF/水混合物中NIR-II纳米探针的PL峰值强度。（i）NIR-II纳米探针在633nm激光照射不同时间间隔后的近红外热成像结果。

接下来，基于该纳米探针良好的生物相容性，作者进行了细胞摄取实验，以观察PC-3细胞对纳米探针的摄取。在PC-3细胞与纳米探针孵育1、6和12小时后，在细胞质中观察到来自纳米探针的双光子荧光，其中荧光强度随孵育时间增加而增加，证明纳米探针被PC-3细胞有效吸收（如图3a和b）。接下来，将PC-3细胞与纳米探针孵育12小时，并用633 nm激光照射6分钟，随后使用流式细胞术和活/死细胞双重染色评估纳米探针的治疗效果。结果表明，在激光照射后（图3c），纳米探针组有58.5%的细胞出现早期萎缩，而PBS组为3.22%，与未辐射的PC-3细胞相比无显著差异。流式细胞术结果通过活/死双重染色进一步验证。在没有激光照射的情况下，PBS和纳米探针组出现分散的死细胞（图3d）。PBS组的死亡细胞数量在照射后没有增加，但是，纳米探针组的大多数细胞死亡，只有少数细胞存活。这些结果证实了纳米探针在体外具有良好的光热转换效率。

图3：（a）含有纳米探针的PC-3细胞培养不同时间后的双光子荧光显微照片。（b）荧光信号强度统计分析。（c） PC-3细胞和纳米探针孵育12h，然后进行633nm激光照射的流式细胞术分析（d）PC-3细胞与纳米探针共孵育12小时，然后用633 nm激光照射（红色荧光表示死细胞细胞核的PI染色，黄绿色荧光表示活细胞的细胞质）的双染色荧光显微照片。

为了获得理想的治疗效果，必须在肿瘤组织中有效积累纳米探针。因此，作者使用纳米探针的NIR-II荧光成像来观察它们在荷瘤小鼠肿瘤组织中的分布和代谢，以指导光热治疗。图4a显示了荷瘤小鼠NIR-II荧光的实时成像结果。尽管荧光信号在尾静脉注射30分钟后分布于荷瘤小鼠全身，但在肝脏中该信号明显较弱，但在注射12小时后肿瘤组织中信号显著增强。此外，注射后48小时，肝脏中的荧光信号进一步减弱，表明纳米探针具有良好的肿瘤靶向特性，并且在肝脏中代谢。此外，我们还观察了静脉注射纳米探针12和48小时后荷瘤小鼠主要器官和肿瘤组织中的体外荧光分布。这些荧光信号主要分布在血液供应丰富的器官，以及注射后12小时的肝脏和脾脏（图4b和d），但注射后48小时显著减少（图4c和d）。然而，肿瘤组织中的荧光信号并未显著减少，这表明纳米探针不仅具有良好的肿瘤聚集特性，而且还可以被生物体有效代谢。

图4：（a）经尾静脉注射纳米探针后不同时间点PC-3荷瘤小鼠的NIR-II荧光图像。（b）通过尾静脉注射纳米探针后12和48小时荷瘤小鼠主要器官和肿瘤组织的亮场图像。（c）与图像b对应的主要器官和肿瘤组织的NIR-II荧光图像。（d）荧光信号强度的统计分析。

最后，作者在PC-3荷瘤小鼠上进行了633nm激光介导的光热治疗。荷瘤小鼠随机分为四组：生理盐水组；生理盐水激光组；纳米探针组；纳米探针激光组。静脉注射生理盐水或纳米探针用或不用激光照射肿瘤8min，在激光照射期间，通过近红外热像仪监测肿瘤的温度。纳米探针组肿瘤部位的温度显著升高，降低激光照射（温度达到43.6℃）。相比之下，生理盐水组的体温只升高了3.6°C，并且没有增加到足以有效杀死肿瘤细胞的温度（42°C）；（图5a和b）。此外，纳米探针激光照射组的肿瘤体积在激光照射后14天内没有增加；其他三组的肿瘤体积显著增加（图5c和d），表明纳米探针注射结合激光治疗的光热疗法显著抑制肿瘤生长。此外，所有组的动物体重都具有可比性（图5e），这表明光热疗法不会对动物造成任何明显的毒性副作用。从各组收集治疗小鼠的主要器官和肿瘤组织，切片，分别进行苏木精和伊红（H&E）染色和TUNEL免疫荧光染色。结果显示，不同治疗组动物的器官中没有明显的病理变化，如细胞水肿和坏死（图5f）。H&E和TUNEL图像显示，经纳米探针和光热疗法治疗的动物肿瘤组织中有大量死亡细胞，但在其他三个治疗组的动物肿瘤中没有。这些结果表明，光热疗法结合纳米探针注射有效抑制肿瘤生长，具有高度的生物安全性。

图5：纳米探针在PC-3荷瘤小鼠体内的光热治疗。（a）633nm激光照射各治疗组荷瘤小鼠的近红外热成像。（b）不同组荷瘤小鼠肿瘤组织温度变化的曲线。（c）不同治疗组小鼠肿瘤体积变化的数据（治疗后21天）。（d）各治疗组荷瘤小鼠肿瘤的照片（治疗后21天）。（e）从每个治疗组的荷瘤小鼠身上切除的肿瘤组织的数据。（f）各治疗组荷瘤小鼠主要器官和肿瘤组织H&E染色和Ki-67免疫染色的图像。

参考文献

Cui Sheng sheng, Fan Shanshan, Tan Hai song, Lu Yi, Zha Yi qian, Xu Bin... & Cui Da xiang.(2021).Ultra-homogeneous NIR-II fluorescent self-assembled nanoprobe with AIE properties for photothermal therapy of prostate cancer.. Nanoscale(2021), doi:10.1039/D1NR04227K.

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