恒光讲堂｜转移性乳腺癌NIR-II光声成像和光热治疗的分子工程方酸纳米探针应用

2021-11-01 18:56:11, 恒光智影上海恒光智影医疗科技有限公司

本文要点：各种方酸染料已被开发用于生物成像。然而，由于缺乏一种简单、通用的设计策略，在第二窗口(近红外Ⅱ 1000−1700 nm)发射的方酸染料的研究报道很少，在这篇文章中，探索了分子工程策略来开发具有NIR-II发射的方酸染料。首先，以1，8-萘内酰亚胺为给体，方酸为受体合成了NIR-I染料SQ2,引入丙二腈作为强吸电子基团使荧光发射红移到NIR-II窗口，合成了SQ1。为了将NIR-II型荧光载体SQ1转化为有效的治疗药物，构建了以纤维连接蛋白为靶点的SQ1纳米探针，在血管造影和肿瘤成像(包括深部组织中的肺转移灶)中显示出优异的NIR-II成像性能。此外，SQ1纳米探针可用于肿瘤的光声成像和光热消融。本研究表明，采用供体−受体工程策略开发近红外-Ⅱ类方酸染料是可行和有效的。

方酸染料SQ1用于转移性乳腺癌的NIR-II/PA双峰成像和光热消融的分子工程和纳米功能化研究方案1.

首先，SQ1纳米探针的构建与表征如图1，具有受体工程的SQ1在930和970 nm处表现出明显的红移(图1b，c)。因此，SQ1的荧光发射延伸到了近红外-Ⅱ区，表明D−A−D工程成功地使SQ1成为近红外-Ⅱ发射体。

图1：(A)SQ1和SQ2有机合成示意图，(B)四氢呋喃(THF)中SQ1和SQ2的吸光度和发射率，(d，e)密度泛函理论(DFT)计算(D)SQ1和(E)SQ2的HOMO和LUMO

为了将近红外荧光团SQ1转化为有效的热敏剂，在超声作用下，将溶解的SQ1与DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-MAL一起在水中纳米沉淀，制备SQ1@DSPE，在转移性乳腺癌细胞中过表达的活性靶向纤维连接蛋白的多肽CREKA通过半胱氨酸(Cys)与SQ1@DSPE的反应被共价连接到SQ1@DSPE上就获得SQ1纳米探针。

图2：SQ1纳米探针的尺寸分析和光物理特性 (A)SQ1纳米探针的DLS和TEM。(B)Sq1纳米探针在PbS中的吸收光谱和荧光光谱，(c，d)近红外-II型荧光图像和(E)伪彩色图像和(F)SQ1纳米探针和SQ2纳米探针，在915 nm光照下的定量曲线，(g，h)含有SQ1、SQ2纳米探针(1 mg/mL)试管在近红外激光(915 nm，100 mW/cm2)照射下，(G)在没有和(H)覆盖猪肉组织的情况下进行NIR-II成像

如图2a所示，透射电子显微镜(TEM)和动态激光光散射(DLS)显示SQ1纳米探针的长度分别约为20 nm和42 nm。与SQ1相比，SQ1纳米探针的吸收峰在930 nm处略有红移至940 nm(图2b)。与SQ1(0.13%)相比，与DSPE-PEG2000结合形成纳米粒子后，SQ1纳米探针的量子产率提高到1.7%。SQ1纳米探针在940 nm处的强吸收也显示了PA成像的潜力。SQ1纳米探针在980 nm处显示荧光峰延伸到NIR-II区域。SQ1型纳米探针的荧光信号与纳米探针浓度呈良好的线性相关(图2c−f)。此外，在含有SQ1和SQ2纳米探针(1 mg/mL)的试管上覆盖猪肉切片，检测组织渗透深度如图2g，h所示，SQ1纳米探针在915 nm(100 mW/cm2)的照射下，其明亮的NIR-II发射可以穿透覆盖的猪肉切片(3 mm)。值得注意的是，DSPE-PEG2000的包裹和肿瘤靶向多肽的修饰几乎没有改变SQ1的光学性质，表明制备良好的SQ1纳米探针适合于NIR-II成像。

图3：(A)SQ1纳米探针和SQ2纳米探针的功率谱,(B)SQ1纳米探针和SQ2纳米探针在930 nm处的PA强度随浓度的变化曲线,(C)SQ1纳米探针和SQ2纳米探针(0.0625、0.125、0.250.5、1.0mg/mL)在930nm处的PA图像(D)SQ1、Q2纳米探针(1 mg/mL)的光热加热图像和(E)SQ1纳米探针(0.125，0.25，0.5，1.0 mg/mL)在近红外激光照射下的温度曲线

接着，还研究了不同浓度的SQ1纳米探针的PA强度和图像。如图3a所示，SQ1纳米探针的PA光谱在930 nm处出现一个峰值，这与最大吸收相一致。根据图3b，c中不同浓度的SQ1纳米探针的PA图像，PA信号与SQ1纳米探针的浓度(0.0625−1 mg/mL)呈线性正相关。因此，将NIR-II成像与PA成像相结合作为双峰成像可以提高乳腺癌的成像准确性。受近红外区高吸收强度的启发，进一步研究了SQ1纳米探针的光热性质。如图3D所示，含有SQ1纳米探针的试管温度从29.3°C上升到70.5°C，而单独含有PbS的试管在激光照射下温度变化不大，SQ2纳米探针的温度略有升高，Q1纳米探针的光热转换效率为25.6%。此外，图3E中的SQ1纳米探针在915 nm激光(0.5W/cm2)照射下表现出浓度依赖性的温度变化，这表明SQ1纳米探针可以用于肿瘤的光热消融。

图4：(a，b)乳腺癌细胞蛋白免疫印迹，(C)冰冻切片检测细胞核(Dapi)和纤维连接蛋白(Alexa Fluor488标记的抗纤维连接蛋白抗体)(比例尺，50μm)，(D)SQ1纳米探针SQ1NP+L处理的乳腺癌细胞存活率(e，f)用0.5 mg/mLSQ1纳米探针(E)在黑暗中或(F)用0.5W/cm2的915 nm激光照射5min，对细胞进行钙调素-AM/碘化丙啶(PI)染色，比例尺：100μm

接下来，为了研究纤连蛋白水平与乳腺癌肿瘤恶性程度之间的依赖性，通过高度恶性MDA-MB-231和低度恶性MCF-7细胞的western印迹测试纤连蛋白。如图4a，b所示，纤维连接蛋白的表达与乳腺癌的恶性程度呈正相关。因此，通过纤维连接蛋白结合肽的修饰，SQ1纳米探针可以用来靶向纤维连接蛋白，并根据乳腺癌肿瘤中纤维连接蛋白水平的差异来识别高危乳腺癌。

为了生物相容性的考虑，用CCK8检测与SQ1纳米探针孵育的MDA-MB231细胞的存活率。SQ1纳米探针显示出较低的细胞毒性，在与SQ1纳米探针(0−512μg/mL)孵育24小时后，80%以上的细胞仍然存活(图4d)。因此，SQ1纳米探针是一种生物相容性显像剂。最终，超过80%的MDA-MB-231细胞被SQ1纳米探针介导的光热效应杀死。SQ1纳米探针(0.5 mg/mL)和近红外激光(0.5W/cm2)预处理的MDA-MB-231细胞几乎全部显示SQ1纳米探针能有效地在体外光热杀灭肿瘤细胞。

图5：SQ1纳米探针的体内成像特性，(A)静脉注射SQ1纳米探针10分钟后，对小鼠血管进行近红外成像(NIR-II)，(b，c)两个区(ROI 1和ROI 2)放大的后肢NIR-II图像，(d，e)ROI1和ROI2后肢红线的荧光强度，(F)静脉注射SQ1纳米探针或SQ1@DSPE(对照)后0、1、2、6、12和24小时，对阳性的MDA-MB-231肿瘤进行NIR-II显像，(G)在NIR-II显像后同时进行肿瘤PA显像，比例尺是2mm

紧接着，为了显示近红外-II成像在血管造影中的优点，静脉注射SQ1100−纳米探针(100μL，100μg)后，用近红外-II成像技术在1000mm1100 nm区域对小鼠血管进行成像。NIR-II成像可以清楚地显示第二个窗口中由于组织穿透增加而导致的皮肤下血管的分布(图5a)。高倍率的NIR-II图像可以清楚地显示通过小鼠后肢动脉的血液流动(图5b，c)。提示NIR-II成像适用于血管造影(图5d，e)。这些结果表明，使用SQ1纳米探针进行血管造影的NIR-II成像是可行的。

然后为了研究SQ1纳米探针在小鼠体内的近红外成像能力，分别对SQ1纳米探针(100μL，100μg)和非靶向SQ1@DSPE(100μL，100μg)进行了研究。如图5f所示，对于注射SQ1纳米探针的小鼠，肿瘤内的NIR-II成像信号显著增强，注射SQ1@DSPE的小鼠肿瘤区域的荧光增强要弱得多。

如NIR-II和PA成像所示，SQ1纳米探针可以很好地累积到MDA-MB-231肿瘤中，这主要是由于SQ1纳米探针的有效主动靶向，而SQ1@DSPE通过被动靶向摄入肿瘤。这些结果表明SQ1纳米探针具有显着的肿瘤靶向成像能力。NIR-II/PA双峰成像显示靶向肽修饰的SQ1纳米探针可以特异性结合纤连蛋白阳性乳腺癌肿瘤。这清楚地表明SQ1纳米探针可以准确地检测和表达纤维连接蛋白阳性乳腺癌的肿瘤病变。

图6：使用SQ1纳米探针对乳腺癌肺转移小鼠的NIR-II成像，(a，b)静脉注射SQ1纳米探针后12h，(A)荷肺转移瘤小鼠和(B)正常小鼠的NIR-II显像，(C)肺转移小鼠和(D)正常小鼠全身NIR-II成像后的器官的体外NIR-II成像，(E)肺转移小鼠和(F)正常小鼠肺切片经NIR-II成像后进行(e，f)H&E组织化学分析，比例尺为200μm

为了进一步评估SQ1纳米探针定位乳腺癌转移性肺部病变的能力。与正常小鼠相比，携带肺转移的小鼠的肺显示增强的NIR-II荧光信号，表明SQ1纳米探针可以选择性地靶向乳腺癌的肺转移病灶（图6a，b）且发现患有转移性乳腺癌的小鼠的肺确实显示出增加的信号，表明SQ1纳米探针在肺转移模型中的肿瘤特异性靶向能力（图6c，d）。如图6e，f所示，携带转移性肿瘤的小鼠肺中的多个病变显示肺切片中存在浸润性肿瘤细胞，这进一步证实SQ1纳米探针能够通过深度穿透来解决乳腺癌的肺转移。

图7：使用SQ1纳米探针(SQ1NP)对小鼠乳腺癌肿瘤进行热成像和PTT，(A)注射PBS或SQ1NP加激光治疗后肿瘤的热成像。(B)光热治疗过程中肿瘤的温度变化，(C)肿瘤生长曲线；(D)治疗期间小鼠生长曲线，(E)PBS、PBS+L、SQ1NP、SQ1NP+L治疗后解剖肿瘤重量，标尺为50μm。

最后，SQ1纳米探针具有良好的肿瘤靶向性和良好的体外治疗效果，进一步促进了对乳腺癌光热治疗的体内评价。如图7a，b所示，注射SQ1纳米探针的小鼠的肿瘤温度从33.2°C迅速上升到59.1°C，而PBS预处理的肿瘤温度没有明显变化。这些结果证实了SQ1纳米探针在近红外辐射下确实能诱导肿瘤发生显著的热变化。为验证其光热治疗效果，对MDAMB-231乳腺癌荷瘤小鼠分别治疗，如图7c所示，随着时间的推移，肿瘤体积的这些差异变得更加明显。此外，小鼠的体重变化与H&E组织化学分析显示SQ1纳米探针在近红外激光照射下对乳腺癌肿瘤有明显的光热损伤作用，具有较高的光热治疗效率。

结论：通过合理的D-A-D工程，合成了一种发射延伸至第二窗口的方碱染料。方酸染料SQ1通过简单的纳米沉淀和靶向多肽修饰可以被包裹成SQ1纳米探针，显示出NIR-II/PA双峰成像能力和良好的光热效应。小鼠的NIR-II显像表明，SQ1纳米探针适合于血管造影和肿瘤靶向显像，尤其是肺转移灶。此外，SQ1纳米探针利用在近红外辐射下优异的光热转换能力，在实体肿瘤的PA成像和PTT中都表现良好。考虑到它在NIR-II区域的治疗学的固有优势，基于方酸的治疗纳米探针将启发其他转移性乳腺癌的创新设计。

参考文献

Yao D, Wang Y, Zou R, Bian K, Liu P, Shen S, Yang W, Zhang B, Wang D. Molecular Engineered Squaraine Nanoprobe for NIR-II/Photoacoustic Imaging and Photothermal Therapy of Metastatic Breast Cancer. ACS Appl Mater Interfaces. 2020 Jan 29;12(4):4276-4284. doi: 10.1021/acsami.9b20147. Epub 2020 Jan 14. PMID: 31896256.

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