关键起始物料有关物质方法开发案例分享

本案例讨论的是一个关键起始物料的有关物质方法，首先要对主成分（ID6）及相关杂质进行结构分析，这组化合物结构中有几个苯环上的位置异构体可能是分离的难点，从下图1的不同化合物的logD vs pH曲线叠图可知，ID5和ID8、ID6和ID7几乎重叠，说明想完全通过疏水性的差异来分离不太可能，根据log_ɑ=log(k/k_EB)=ȠH-δS+βA+ɑB+κC这个经典的经验公式（文献¹），我们可以考虑除了疏水性以外的其他作用力，比如氢键、空间位阻、离子作用等，但这个案例分离主要依靠不同化合物之间的π-π、疏水性、氢键作用力及空间位阻的大小差异等来进行分离，而能同时满足以上分离要求的色谱柱我们首先想到的是苯基键合的色谱柱（如PFP、C18-PFP、BIPFP等色谱柱），但上述经验公式并未包含π-π键的作用力，而K.Croes, A. Steffens, D.H Marchand, L.R. Snyder等人²在J.Chromatogr. A 1098 (2005)123-130发表的文献中总结了新的经验公式对上述公式进行了补充，增加了π-π键和偶极-偶极作用力的说明，公式如下：

log_ɑ=log(k/k_EB)=ȠH-δS+βA+ɑB+κC+πP+μD

当P>0时，发生在苯基柱和氰基柱上（π-π键作用力）；

当D>0时，仅发生在氰基柱上；

当P和D=0时¹，发生在其他色谱柱上。

此外，各化合物除了ID1、ID3、ID4有弱酸基团酚羟基（pKa预测结果如下），其他化合物均无酸碱基团，故本方法pH不会是关键参数。考虑各化合物结构中都含有不同的氢键作用位点（羟基、醚键、羰基等），那么甲醇作为氢质子供体必然是很友好的有机相，而乙腈同样能在色谱柱及化合物之间产生或抑制π-π键的作用，也会产生不一样的选择性差异，所以甲醇和乙腈的混合比例筛选是我们可以考虑的一个因素。再从ACD软件预测的logD vs pH曲线叠图中可知，这组化合物的logD均大于0，所以保留不是问题，在设置梯度时起始有机相比例可适当提高。

图1. 目标物质logD vs pH曲线叠图（pH Selector出图）

根据我们前期的筛选结果，发现ACE C18-PFP（包括疏水性、π-π作用、氢键和形状选择性等）对这组化合物的分离最好，色谱柱确定后进入了优化阶段，仅对有机相（水相采用的是可与LCMS兼容的0.1%酸性体系）、梯度、柱温等进行研究。在方法优化过程中分离度Rs是我们主要关注的目标函数，我们需要根据分离度经验公式不断调整优化策略，公式如下：

备注：其中α与Rs是一次线性的关系，所以α对分离度值是影响最大的参数，也是我们分离过程中需要关注的主要矛盾。

2.1 有机相种类筛选

我们知道常规反相色谱中对选择性α有2个“＋”的参数（见文献3第二章）除了色谱柱和pH值外，最重要的就是有机相种类，根据理论分析，本案例甲醇的选择性可能会比乙腈更好，故首先考察了流动相B为100%甲醇时的分离情况，结果经过优化后，除关键分离对ID6和ID7以外（ATP），其他杂质的分离均较好，结果见图2。

图2. 100%甲醇作为有机相的优化结果

为进一步改善ID6和ID7的分离情况（优化选择性α），考虑在100%甲醇中加入不同比例的乙腈对比选择性差异，结果如图3所示，当乙腈含量较高时，ID6比ID7先洗脱；logα＜0（k1为ID6，k2为ID7），当乙腈与甲醇比例1:1时，logα=0（k1=k2），ID6与ID7共洗脱；当乙腈含量较低时，ID6比ID7后洗脱，logα＞0；以甲醇在乙腈中的比例作为横坐标，logα作为纵坐标作图，可以看出当点穿过横坐标时（logα=0）分别位于第I和第IV象限，洗脱顺序出现了翻转，而且90%的甲醇-乙腈分离最好。可能由于ID7理论上疏水性比ID6更小，常规反相上洗脱顺序应是ID7、ID6依次出峰，但本案例使用了特殊的PFP色谱柱，甲醇和乙腈的不同比例会影响π-π键的作用力强度，同时ID6比ID7结构上多了一个氢键的作用位点，甲醇比例更高时ID7氢键作用更明显，造成保留翻转。为了保证方法的耐用性，我们需要找到最佳的可操作空间，故结合ACD软件分别进行了二维和三维模拟实验。

图3.不同有机相比例的分离结果

图4. 关键分离对（ID6与ID7）的logα与不同甲醇-乙腈比例作图

2.2 温度与梯度二维模拟

前期研究柱温并未作为关键方法参数进行筛选，但根据文献报道⁴，柱温和梯度对结构类似物的分离很重要，故先设计了温度（logk=logA+B/Tk）与梯度（logk=logkw-φS）的2因素2*3的实验。利用ACD/LC-Simulator创建梯度温度2D模型，如图5。通过模拟结果发现，ID6与ID7在梯度时间较短的范围内可以基线分离的空间较窄，方法耐用性可能不好，故需继续设计三维模拟实验。

图5. 梯度温度2因素模型

2.3 温度、梯度、混合有机相三维模拟（DOE）

根据前面研究的结果，明确了分离目标，构建了一定的知识空间，也通过方法筛选对关键的参数进行了简单的风险评估，最后再针对性的设计了包含梯度、混合有机相比例及温度3因素的DOE试验，并构建3D模型，如图6所示。

图6. 梯度、混合流动相、温度3因素模型

通过对模型的分析，柱温越低分离越好，梯度时间越长分离也越好，关键分离对ID6与ID7在高比例甲醇或者乙腈下都可以找到一个合适的方法，但是当乙腈含量较高时，ID7在ID6（主成分）之后出峰，在不同品牌仪器上进行方法转移或柱效下降时，分离的风险较大。最后我们根据三维模拟的结果选择最佳的色谱条件为：有机相甲醇-乙腈的比例为9：1；柱温25℃；线性梯度时间为35分钟。此时预测的色谱图中关键分离对的Rs达到3.0以上。ACD/LC-Simulator预测的分离结果见图7所示，实际测定的结果如图8所示。

图7.ACD软件预测图

图8. 实际测定谱图

2.4 耐用性考察

利用ACD软件对上述确定的方法做了详细的耐用性考察，结果色谱条件在一定范围内进行变动时，各杂质以及关键分离对ID6和ID7的分离度均能符合要求（大于2.0），实际验证结果如图9。

图9. 耐用性验证图谱

杂质谱研究不仅仅是原料药和制剂成品关注的重点，也是起始物料最关注和最难的点，我们通常采取分步控制的策略，从源头控制，这样可以降低最终成品质量研究的压力和成本。不同的项目合成路线不同，化合物结构千差万别，杂质谱研究研无止境，随着新药研究的逐步发展，对于分析研发人员的方法开发能力越来越挑战，但无论什么项目我们都应该从化学结构的根本出发，采用科学的思维方法，理解被分离物质的特性并结合色谱理论进行分析，同时借助一些特殊的色谱工具（如日新月异的色谱柱填料）和ACD计算机辅助软件等，告别传统的trial & error研究模式，一定能给我们的质量研究工作带来事半功倍的效果。

1. N.S. Wilson , M.D. Nelson , J.W. Dolan , L.R. Snyder , R.G. Wolcott , P.W. Car，

Columnselectivity in reversed-phase liquid chromatography I. A generalquantitative relationship,J.Chromatography A, 961 (2002) 171-193）.

2. K. Croes, A. Steffens, D.H Marchand, L.R. Snyder, Relevance of π–π and dipole

–dipoleinteractions for retention on cyano and phenyl columns inreversed-phase liquid chromatography, J. Chromatography A, 1098(2005) 123-130.

3. 现代液相色谱技术导论.第三版。

4. LR Snyder, JW Dolan, Reversed-phase separation of achiral isomers by varying temperature and either gradient time or solvent strength,Journalof Chromatography A, 892 (2000) 107–121.

END