ACD/ AutoChrom软件在有关物质方法开发中的应用

方法中待控制杂质LogD-pH图如下。

图2待测化合物LogD-pH图

（其中主成分和化合物2，化合物7和8分别为两对位置异构体logD曲线重叠）

根据上述LogD图可知，化合物3~6在pH小于6时，分离与保留均较好。但化合物1和化合物2的LogD图基本重叠，化合物2与主成分、化合物7与化合物8均为非对应异构体，无法完全借助疏水性差异进行分离。

考虑本品主峰及各已知杂质的结构中均含有羟基、脂肪胺、苯基与酯基等，有丰富的氢键、疏水、空间位阻和π-π键作用位点，故选择对上述基团及非对应异构体具有较好选择性的色谱柱（GL Sciences Inertsil Ph-3）进行研究。根据logD图，在酸性pH条件下为各杂质的保留稳定区，故选择一个酸性pH作为流动相pH即可。因本品结构中含多个碱性较强的脂肪胺，前期经过筛选确定选择对碱性化合物峰型修饰效果较好的0.1%高氯酸+10mmol/L六氟磷酸钾体系作为流动相A增加保留，改善化合物峰型。采用上述色谱柱和流动相体系初步筛选时发现，大部分化合物较容易分离，但化合物1、化合物2与主峰分离较差，分别在主峰附近出峰，继续优化梯度均无法同时改善化合物1、化合物2与主峰分离，典型图谱如下：

图3：初步筛选时典型图谱

但在优化过程中发现同时调整柱温和流动相梯度，能调节主峰、化合物1与化合物2的保留与分离，能发现这几个化合物对柱温和梯度较敏感，并考虑到需要分离位置异构体，设计了梯度，温度和混合溶剂比3因素实验，借助ACD软件进行模拟与优化。

梯度，温度和有机相混合比实验设计如表1：

表1：梯度、柱温和有机相B种类三因素水平正交试验设计

按照设计的试验，得到18组数据，将这些数据导入ACD/Spechrus Processor中进行谱图处理，最终利用LC-Simulator得到了基于柱温、流动相B种类和梯度的3D分离度图，如图4所示。

图4：ACD软件三因素模拟结果

图4中显示的3D分离度图中，颜色越接近高色温区（橙红色），各杂质分离度越好。

图4中b~d是从三维图中截取分离度最好的三张二维截面图，其中图b为梯度时间-柱温二维图（有机相比例为纯甲醇），图c为梯度时间-有机相比例二维图（柱温为25℃），图d为有机相比例-柱温二维图（梯度时间为40分钟），该色谱条件下，杂质均有较好分离，均大于3.0。

对该方法（预测方法1）进行重现，结果如图5

图5（预测方法1）软件预测图谱与方法重现图谱对比

预测方法（预测方法1）重现结果，各杂质分离良好，均互不干扰，但在进样过程中发现，基线抬起较严重，杂质灵敏度不好；由于主峰和大部分杂质均为末端吸收，选择了210nm作为检测波长，该波长下甲醇有吸收，对灵敏度有影响，故需降低甲醇比例。

图6不同有机相比例基线对比

同时，在该预测方法（模拟方法1）下，系统压力较高，梯度中最高压力能达到400bar，对色谱柱伤害较大，一方面是由于甲醇粘度较大，另一方面是由于柱温较低，导致柱压偏高。