还能分得更精细？最全的人肺内皮细胞单细胞图谱

肺是一个高度血管化的器官，参与两个血液循环系统：体循环向胸膜供应含氧血液，肺循环向肺提供缺氧的血液。两个循环涉及到不同的细胞类型，其中肺部内皮细胞（EC）至关重要，它不仅是血液，空气和基质组织之间的物理屏障，还具有代谢活性，参与炎症控制、白细胞运输、血管生成和血管张力等过程。科学研究发现，很多临床疾病的发生与肺部EC的功能障碍相关，包括急性呼吸窘迫综合征、慢性阻塞性肺病、肺纤维化、肺炎、自身免疫性疾病、肺动脉高压等。

近日，耶鲁大学医学院的Schupp等人利用单细胞转录组测序技术，确定了六个肺EC亚型：淋巴EC、动脉EC、普通毛细血管EC和Aerocyte，以及新发现的肺静脉EC和全身静脉EC。配体-受体连接组分析（connectome analysis）揭示了肺部EC在与其他肺部常驻细胞类型的稳态交流中的重要作用。认识肺内皮细胞的多样性，对探索疾病相关基因和研发新的治疗方法提供了依据。

Schupp等人收集了6组不同的scRNAseq (single-cell RNA sequencing) 数据并用相同的生信分析方式进行分析，通过与已建立典型标志物表达特征的细胞类型比较，确定了这些细胞是37种不同的肺部细胞，最终得到了来自73个个体超过15000个血管内皮细胞。

Figure1. 研究总览

基于典型内皮细胞标志物PECAM1, CDH5(VE-cadherin), CLDN5及ERG，12563个内皮细胞被识别。随后，147个泛内皮细胞标志物被确认。肺部内皮细胞被可被分为两类群体，血管内皮细胞和淋巴内皮细胞。在这两组细胞中，确认了其对应的内皮细胞标志物，如淋巴内皮细胞标志物，转录因子TBX1、HOXD3、NR2F1、NR2F2等。

Figure2. 通过单细胞测序评估粗粒内皮细胞异质性

基于典型标志物的表达情况，血管内皮细胞可被分为动脉，静脉和毛细血管内皮细胞。除此以外，以上三类细胞还基于各自的与实现细胞功能相关的基因进行分类，例如毛细血管内皮细胞表达与气体交换有关的酶的基因CA4和CYB5A。

Figure 3. 通过单细胞测序评估细粒内皮细胞异质性

scRNAseq结果显示，之前观察到的vWF(von Willebrand factor)、THBD(thrombomodulin)和EMCN(endomucin)以及EDN1(endothelin 1)和EDNRB(endothelin receptor B1)在肺部毛细血管中斑块状或镶嵌状的组织学染色模式可以归结为两个群体：气管细胞和一般毛细血管内皮细胞。气管细胞可以通过其编码的EDNRB等方式识别。一般毛细血管内皮细胞是最普通的血管细胞类型，他们只特异性表达140个基因。通过免疫荧光技术和原位杂交技术发现，这两种细胞均位于肺泡壁的内皮中。

Figure4. 气管细胞和一般毛细血管内皮细胞的定位

根据免疫荧光染色和样品的组织来源，作者将2个静脉亚群分配到系统和肺循环中：系统静脉内皮细胞（COL15A1pos），定位于气道和内脏胸膜；肺静脉内皮细胞（COL15A1neg），定位于肺实质。此外，基于scRNAseq数据集，作者还发现了一些新的细胞标志物，例如系统静脉内皮细胞编码包括EBF1, EBF3, MEOX1, MEOX2, 和ZNF385D在内的转录因子。

Figure 5. 系统静脉内皮细胞位于气道和内脏胸膜

像肺部这样的复杂组织有不同的cellular niches，cellular niches受到细胞间交流的严格调控进而发挥功能。为了研究内皮细胞在人类肺部组织稳态中的作用，作者进行了细胞connectomics分析，即将每种细胞类型的平均基因表达与NicheNet数据库中已知的配体-受体相互作用进行了映射，进而寻找涉及到肺部内皮细胞的配体-受体。Schupp等人发现动脉内皮细胞是最活跃的配体发送者，可以表达Notch配体，被周细胞和平滑肌细胞（SMC）中的NOTCH3感知等现象。

Figure6. 以内皮细胞为中心的细胞间交流

与肺动脉高压有关的BMPR2在所有的内皮细胞中都有表达，但SOX17只在动脉内皮细胞中表达，scRNAseq数据集重分析结果显示，肺动脉高压患者的肺部可以观察到所有的血管内皮亚群。但通过商业途径获得的原生动脉、微血管和静脉肺内皮细胞失去了各自的本地肺表型。

作者证实，所有6种内皮细胞类型，包括系统静脉内皮细胞和气管细胞，都存在于小鼠体内。并确定了在人类和小鼠中保守的内皮细胞标记基因。

Figure7. 人类和小鼠中保守的内皮细胞群体和保守的标记基因

如何评估检测特定的基因对细胞分类的作用？

作者通过计算diagnostics odds ratio (DOR)评判该基因的分类能力，计算公式如下：

其中TruePositives代表集群内检测到表达该基因的细胞数，FalsePositives代表集群外检测到表达该基因的细胞数，FalseNegatives代表集群内没有检测到该基因表达的细胞数，TrueNegatives代表集群外没有检测到表达该基因的细胞数，并对最终的结果进行log转化。

如何利用Connectome分析研究细胞-细胞的信号传导？

作者利用R包Connectome (v0.2.2)将内皮细胞的数据与NicheNet ligand-receptor interaction数据库比对。简而言之，每个细胞类型被视为一个单一的节点来创建网络。在每个细胞类型的基础上，计算所有数据槽中所有配体和受体基因的平均表达值。并创建了一个未经过滤的边缘列表（"connectome"），将配体的所有生产者与受体的所有生产者联系起来，并有相关的定量边缘属性。此次筛选只保留广泛为所知的和文献支持的ligand-receptor interactions。