收藏！药典变化详解之无菌检查法（一）

对比2015版药典四部-无菌检查法(2020版药典四部删除部分)，2020版药典四部-无菌检查法(2020版药典四部增加部分)。

无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器械、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供拭品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。

隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验需对试验环境进行监控测。

培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基商品化的预制培养基。

配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在若不即时使用，应置于无菌密闭容器中，在2-25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用下保存，并在经验证的保存期内使用。

除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节 PH为弱碱性，煮沸，滤清，加人葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节PH, 使灭菌后在25℃ 的PH值为7.1土0.2。分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。灭菌。

在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/3 1/5,否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。

除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养基置30-35℃培养。

该项目下2020版药典四部通则与 2015版药典四部通则内容无变化。

按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培养基灭菌前或使用前加人适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法适用性试验。

该项目下2020版药典四部通则与 2015版药典四部通则内容无变化。

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取马铃薯，切成小块，加水1000ml，煮沸 20-30分钟，用6-8层纱布过滤，取滤液补水至1000ml，调节 PH使灭菌后在25℃的PH值为5.6±0.2，加入琼脂，加热溶化后，再加人葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。

每批培养基一般随机取不少5支（瓶），置各培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。

培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代(从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存和确认，以保证试验菌株的生物学特性。

除上述内容外其他内容无变化。

接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30-35℃培养18-24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20-25℃培养24-48小时2-3天，上述培养物用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数每小1ml于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液适宜浓度菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，20-25℃培养5-7天或直到获得丰富的孢子，加入3-5ml适量含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的 PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9% 无菌氯化钠溶液制成1ml含菌数小于100cfu适宜浓度的孢子悬液。

菌悬液若在室温下放置，一般应在2 小时内使用；若保存在2-8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。

培养基接种取每管装量为12ml适宜装量的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照,培养3天；取每管装量为9ml适宜装量的胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于不大于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。接种细菌的培养管培养时间不超过3天，接种真菌的培养管培养时间不得超过5 天。

结果判定空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。

稀释液、冲洗液配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

根据供试品的特性，可选用其他经验证的适宜溶液作为稀释液或冲洗液（如0.9% 无菌氯化钠溶液）。

如需要，可在上述稀释液或冲洗液的灭菌前或灭菌后加入表面活性剂或中和剂等。

除大肠埃希菌(Esherichia coli) [CMCC(B)44102]外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌株及菌液制备同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌(Esherichia coli) [CMCC(B)44102]的菌液制备同金黄色葡萄球菌。

按供试品的无菌检查要求，取每种培养基规定接种的供试品总量，采用薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于不大于100cfu的试验菌，过滤。

加硫乙醇盐酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基培养基至滤筒内，接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢 梭菌的滤筒内加硫乙醇酸盐流体培养基；接种枯草芽孢杆菌 、白色念珠菌、黑曲霉的滤筒内加胰酪大豆胨液体培养基 。另取一装有同体积培养基的容器，加人等量试验菌，作为对照。置规定温度培养，培养时间不得超过5天，各试验菌同法操作。

取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基 6 管，分别接入小于不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各 2 管；

取符合直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨液体培养基6管，分别接人小于不大于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。

其中1管按供试品的无菌检查要求，接人每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，置规定的温度培养，培养时间不得超过5 天。

该项目下2020版药典四部通则与 2015版药典四部通则内容无变化。

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