2021-07-07 18:10:06, 陈老湿 德国赛多利斯集团
分子垂钓是生命科学研究中的常用手段,简单来说就是从一个分子库里(比如某个细胞裂解液的粗样品)钓取可以与已知生物分子相结合的配体分子。一般先将这个已知分子偶联在固相上面,然后和细胞裂解液里的物质结合,最终将洗脱下样品交由质谱进行鉴定。
一个成功的垂钓实验会涉及到几个重要因素
1
将已知分子牢固地偶联到固相上,并保持其生物活性;
2
尽量减少混合样品和固相之间的非特异性结合;
3
确保洗脱的物质有足够的量来做质谱(浓度尽可能高,避免浓缩处理导致的损耗);
4
对垂钓鉴定结果进行验证。应用经纯化的样品,再次通过分子互作技术进行表征鉴定。
目前最常用的垂钓方法是Pull-Down,但是其缺点是非特异性高,操作麻烦。现在基于生物层干涉技术(BLI)的Octet分子互作仪器以及传感器,针对这几个问题进行了积极的优化和改进,成为做分子垂钓的新方法。
今天陈老湿给大家介绍一篇文章,来自于意大利国家研究委员会下属的生物结构和生物成像研究所的。他们在研究中发现了针对某一肿瘤标志物的抗体,并成功应用BLI技术垂钓和鉴定出这个抗体的表位(抗体结合位点)【1】。
来自意大利科学家的BLI垂钓案例经典技术路线
Preferentially Expressed Antigen in Melanoma (PRAME,黑色素瘤特异性抗原) 是重要的肿瘤标志物和治疗靶点。科学家通过研究,发现了针对这个抗原的高亲和力抗体。接下来的工作就是希望通过分子垂钓技术,对该抗体的识别表位开展鉴定工作。
下图是做表位垂钓和鉴定的技术路线
1
先用BLI鉴定抗体与抗原结合。用胺基偶联传感器固化抗体,通过与抗原进行结合解离得到的数据,确认该抗体与抗原的结合亲和力较高;
2
将抗原用胰蛋白酶消化成多肽,并用质谱开展鉴定。通过同蛋白序列的分析对比,发现这些多肽序列的覆盖率很高,从而确认抗原预处理是成功的;
3
应用Octet AR2G(胺基偶联传感器)固化抗体,抓取抗原消化产物,并用质谱开展鉴定;
4
对鉴定得到的能与抗体结合的多肽序列进行人工合成,并标记上生物素标签;
5
采用Octet互作分析仪,用链霉亲和素(SA)传感器固化生物素化多肽,与抗体结合解离,鉴定多肽与抗体的亲和力。
由此可见,Octet不仅可以作为整个抗原和表位多肽的亲和力鉴定手段,同样也是用于垂钓表位多肽的工具,两全其美!
BLI垂钓方法的关键技术点
作者将几微升1μM浓度的抗原进行消化后,将其与固化了抗体的AR2G传感器在试管中孵育3分钟。随后用PBS缓冲液洗涤1分钟,最后用0.1%的TFA洗脱(该洗脱液可以兼容质谱)。重复该过程10次以确保积累足够多的洗脱产物。
BLI垂钓的质谱鉴定结果:除去一些角蛋白的污染物多肽(K2,K3,K4)外,有一个PRAME(202-212)相关的多肽片段。
通过BLI技术发现并确认了PRAME与抗体的潜在表位位置在202-212!另外,陈老湿必须提醒大家,在质谱鉴定垂钓产物中,角蛋白相关多肽作为污染物被发现的概率非常高。因为这个蛋白大量存在于皮肤毛发中,所以其作为污染物可能在EP管等各种溶液容器中普遍存在,请大家在做实验的时候尽量注意这点。
BLI的传感器还有一个优点就是可以和PCR管完美配合。只要在PCR管里加入10ul左右的样品或者洗脱液,并将传感器直接插入试管,就可以轻松完成垂钓。
用BLI进一步对垂钓产物进行鉴定
潜在位点毕竟是潜在位点,垂钓毕竟是垂钓,对这个多肽与抗体的结合进行进一步鉴定是必不可少的。这个基于BLI技术的非标记技术和直接结合(direct binding)又可以大显身手了。BLI技术可直接对两个生物分子之间进行实时的相互作用检测,最大程度保证结果的真实性。同时实时监测的结果能够为研究者展示相互作用的过程,得到Kon、Koff、KD等重要的动力学表征参数。Octet系统凭借测试速度快,步骤少,自动化程度高,数据重复性好,结果准确率高等优点,已成为当前市场上最主要的分子互作工具之一。
垂钓产物的鉴定:将生物素化PRAME(202-212)固化在链霉亲和素传感器上,与抗体的有明显结合(A图),而PRAME(202-212)的 突变体与抗体没有明显结合(B图)
陈老湿给大家划一下今天的重点!
应用Octet开展分子垂钓的优势
1
提供多种传感器固化已知分子
2
可以到达到ng级以上的洗脱量(如果传感器上结合量够大,做SDS-PAGE都够,请看这里),并实现微量洗脱
3
提供较低非特异性吸附的基质
4
通过直接结合实验来验证鉴定垂钓产物
5
易于操作,实验成本低
还犹豫什么呢,赶紧用Octet来试试分子垂钓吧!
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-参考文献-
【1】Development of a New Highly Selective Monoclonal Antibody against Preferentially Expressed Antigen in Melanoma (PRAME) and Identification of the Target Epitope by Bio-Layer Interferometry. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3166. https://doi.org/10.3390/ ijms22063166
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