【清明祭实验动物】要缅怀也要最大限度地挽救

下面分享上海九院秦安医生的实验动物操作案例，该步骤可以大大减少实验动物用量。愿各位都能在实践中，为了小动物，去优化实验方案。这里用卵巢切除（OVX）骨质疏松小鼠的取材为例进行介绍：

1. 小鼠麻醉后，我们一般先进行大体拍照，称体重，记录下相应数据。如果有必要，可以进行小动物 X 线扫描，记录小鼠整体骨骼 X 线特征。

2. 小鼠取材时候，我们先进行眼球后去血，取血包括两部分，一部分是全血，取了放进抗凝管，需要马上送检进行血细胞技术等相关分析（这部分一般比较少做）。一部分是血清，一般通过静置，4 度 1500 rpm 离心 20 min 获得。获得血清后，我们一般分几个 EP 管进行分装，用于后续的血清学指标检测和骨代谢相关指标检测。其中骨代谢相关指标主要包括成骨相关的 OC，P1NP 和破骨相关的 CTx 等。

3. 取血完成后，我们一般取上肢骨组织，一般将上肢的肱骨和尺桡骨都取下来，剔清肌肉组织，然后将骨组织放入液氮快速冷冻，然后放入含有 1 ml Trizol 的 EP 管理，放在-80 度备用。等有时间的时候，我们会将组织放入研钵里研磨碎骨组织。当然，我们也用快速骨组织粉碎机器，这样效率来的比较高。研磨碎后，我们会加入氯仿，静置、离心后提取上清，上清再用 RNA 提取试剂盒提取 RNA，放-80 度保存，用于后续骨组织相关基因的检测。比如成骨的 RunX2，ALP, OC，Col1，破骨的 TRAP， Ctsk, CTR, 骨细胞的 DMP-1， Sclerostin 等，根据需要，要做多少分析就做多少分析。

4. 取完上肢骨组织后，我们一般会取小鼠脾脏组织。然后将脾脏组织放入 aMEM 培养基里待用。脾脏组织里含有大量的造血干细胞，通过脾脏组织研碎，加入含有 M-CSF 的培养基贴壁培养后，可以得到脾脏来源的单核巨噬细胞，后续可以用于单核巨噬细胞的研究和破骨细胞的体外细胞学实验研究。

5. 取完脾脏后，我们一般先取小鼠右下肢。如果需要进行生物力学分析，我们一般取小鼠右下肢股骨，取下的标本用湿盐水巾包裹后放在-20 度冰箱里保存，用于后续做生物力学分析。然后小鼠的右胫骨，我们则放入培养基中，等有空时，通过冲洗骨髓获得骨髓血，后续可进行培养获得间充质干细胞或单核巨噬细胞。

6. 取完右下肢后，我们取腰椎，L1 到 3 用 PFA 固定做 microCT 扫描和组织学分析用（同下），L3 以下盐水巾包裹做生物力学分析（同上）。

7. 最后，我们一般取小鼠的左下肢。从股骨头上方进行离断。剔除肌肉组织后，获得股骨和胫腓骨。我们一般在股骨颈处剪断，在胫骨远端剪断，然后将骨组织放入 4% 的 PFA 里固定 48 小时。剪断的目的是为了让固定液充分渗透进入组织。48 小时后，用 PBS 冲洗三次，然后用 70% 的酒精固定。

酒精固定后，骨组织首先送 microCT 扫描，如果要分析骨小梁，一般选股骨远端生长板上方骨小梁，胫骨近端生长板下放骨小梁，进行 microCT 扫描分析，分析主要参数包括 BV/TV，Tb.Th, Tb,N, Tb,Sp 等。如果要分析皮质相关参数，一般选股骨中段和胫骨中段皮质骨进行分析，分析主要参数包括 BV/TV， Cort.Th 等。

microCT 回来的组织，我们一般股骨进行树脂包埋，做硬组织切片后可进行各种染色，进行骨形态计量学分析。当然，如果小鼠在取材前进行了两次荧光双标标记的话，硬组织切片可以观察两次荧光标记之间的平均距离，从而可以计算成骨速率。

microCT 回来的胫骨，我们则放入快速脱钙机器中进行脱钙。一般两天完成脱钙后，进行石蜡包埋切片，然后做常规的 HE 染色，破骨细胞做 TRAP 染色，其余需要的免疫组化做相应的免疫组化染色，用于各种后续分析。

部分内容来源于转化医学网和生物学霸