细胞特异性线粒体快速分离新技术：PolyAn 链霉亲和素（Streptavidin）修饰玻片原位固定细胞线粒体，进行线粒体细胞类型特异性分析

2026-06-18 17:35:21, 环亚生物环亚生物科技有限公司

多细胞生物的生命活动依靠线粒体进行供能。除合成三磷酸腺苷（ATP）外，线粒体还参与信号传导、氧化还原稳态维持以及细胞程序性死亡等数十种细胞生理过程。已有大量研究证实，不同组织甚至同一细胞内部的线粒体均存在显著差异。例如小鼠的肝脏线粒体富集次生代谢与外源物解毒相关通路，而脑组织线粒体主要参与蛋白分选、三羧酸（TCA）循环及线粒体分裂过程。

植物典型的源组织叶肉，执行光合作用和光能转化。日间叶肉细胞的线粒体消耗过剩的NADPH、参与光呼吸辅助叶绿体代谢；夜间，成为ATP的主要供给场所。而植物叶片表皮的保卫细胞，依靠 ATP 驱动质子泵维持并快速调整膨压，控制叶片二氧化碳摄入与水分散失。尽管两种细胞位置相邻、协同供给植株碳素，但日间代谢分工截然不同。二者线粒体功能分化的分子机制尚不清楚，现有细胞特异性线粒体分离技术多依赖流式分选、组织预分离等技术，操作繁琐、回收率低，目前缺少简便通用、可实现单细胞线粒体固定观测的富集手段，亟需开发新型分离工具。

文章题目为“Mitochondrial Cell-Type-Specific Profiling: Differential Function of Mesophyll and Guard Cells is Reflected by Their Mitochondrial Proteome”于2025年9月发表在Physiologia Plantarum杂志，作者来自于德国不莱梅大学生物分子相互作用中心。

本研究利用细胞特异性线粒体快速分离技术（mRACE）分别从拟南芥根培养物、幼苗、整叶以及叶肉、保卫细胞中分离线粒体并开展蛋白组研究。结果证实，叶肉与保卫细胞线粒体在代谢、翻译调控、RNA 编辑等多个层面存在分子组成差异；选取关键基因进行体内启动子报告实验，结果与蛋白组数据相互印证，证明 mRACE 是发掘不同细胞线粒体差异组分的可靠技术。

研究方法

样本

拟南芥Col-0野生型，分别培育整株幼苗、离体根培养物以及成熟叶片。

mRACE 技术（细胞特异性线粒体快速分离技术）

构建双转基因系统：MTF融合蛋白（线粒体外膜OM64靶向序列+ GFP+生物素标记位点BLRP）与BirA生物素连接酶共表达，BirA 可对 MTF 的 BLRP 位点生物素修饰，依靠生物素 - 链霉亲和素互作捕获标记线粒体。mRACE分三种分离方案：分别是磁珠富集、PolyAn链霉亲和素修饰玻片固定以及分级过滤结合玻片固定。

1）磁珠法：冰上KPBS缓冲液匀浆→粗过滤→两步差速离心富集线粒体沉淀→链霉亲和素磁珠孵育结合→多梯度体积缓冲液磁珠洗涤，SDT 缓冲液煮沸洗脱蛋白；

2） PolyAn链霉亲和素修饰玻片固定：幼苗匀浆过滤离心获取线粒体悬液→滴加至PolyAn链霉亲和素玻片4℃孵育结合→KPBS多次摇洗去除游离杂质→玻片直接上机荧光成像；

3）两级滤网快速过滤法：30μm+5μm滤网分级过滤裂解液，差速梯度离心后线粒体离心固载于普通盖玻片，用于活性测定。

PolyAn链霉亲和素玻片特异性固定纯化线粒体：玻片表面共价交联链霉亲和素后，仅生物素修饰的MTF标记线粒体可特异性结合，未标记细胞器、细胞碎片、杂蛋白可被洗涤去除，实现单一细胞来源线粒体得原位富集。

单细胞 / 单线粒体原位观测平台

线粒体固定在链霉亲和素玻片表面，无需洗脱收集，可直接置于倒置荧光显微镜下原位成像，实现单线粒体形态、荧光定位观察（图1H）。

活体生理活性检测

在链霉亲和素玻片上直接添加呼吸底物（琥珀酸、ATP）与抑制剂（鱼藤酮），依托cpYFP荧光探针原位测定单个线粒体呼吸与 pH 动态变化，验证分离线粒体d的生理完整性。

区别于磁珠悬浮富集，PolyAn链霉亲和素玻片固定便于多轮洗涤，杂质去除效率更高，适配微量样本（如：幼苗少量组织来源线粒体）的分离与后续显微功能分析。

图1 利用mRACE技术分离与分析特定细胞、组织来源的线粒体

(A) 依托嵌合蛋白MTF实现功能：MTF由OM64线粒体靶向序列、绿色荧光蛋白GFP与生物素受体位点构成；在生物素连接酶BirA存在条件下，该受体位点可被生物素标记。

(B~E) mRACE标记线粒体可跨不同界生物适用。分别在拟南芥 (B)、人胚肾细胞系 (C)、大鼠胰岛β细胞系INS‑1E (D，DAPI 染细胞核，图示5个细胞中仅1个过表达 MTF，TOM20蛋白在全部细胞稳定表达)、秀丽隐杆线虫 (E) 中过表达MTF，通过GFP 与线粒体探针MitoTracker Red CMXRos或线粒体外膜标记蛋白TOM20共染，证实MTF定位于线粒体。

(F) F1：利用磁珠结合+磁力吸附捕获生物素标记线粒体；F2：使用链霉亲和素修饰玻片，依靠亲和作用固定标记线粒体；F3：先后经30μm、5μm两级滤器快速分选荧光标记线粒体，再通过离心将线粒体固载于玻片。

(G) 采用F1方案，从携带p35S::MTF、p35S::BirA的拟南芥根中分离磁珠结合型线粒体；左：明场、中：荧光场、右：叠加图。

(H) F2方案下固载在链霉亲和素玻片上的生物素化线粒体富集效果：左为双基因表达实验组，右为仅含p35S::MTF的空白对照。

(I) F3 分级过滤获得MTF标记线粒体，经离心固定在玻片上的富集结果。

(J) F3 制备并固载于玻片的单个cpYFP标记线粒体活性检测。左图：分别用10mM琥珀酸+0.25mM ATP+20μM 鱼藤酮激活处理 (绿色)、基础培养液空白处理 (米色) 后，单个线粒体荧光强度定量；右图：6个线粒体经两种处理后的cpYFP荧光动态曲线。

标尺：B/C/E=2μm；D=10μm；G=1μm；H/I=10μm；J=0.2μm

研究结论

mRACE 通用性优异：MTF 可在植物、哺乳动物、线虫等真核生物中精准标记线粒体外膜；经磁珠或PolyAn 链霉亲和素修饰玻片富集的线粒体结构完整、具备呼吸生理活性，分级过滤方案可 10 min 快速富集线粒体。
mRACE 高效富集微量特异细胞线粒体：保卫细胞数量远低于叶肉细胞，仍能富集其高纯度的线粒体蛋白；根、幼苗、叶片线粒体蛋白组既有共有蛋白，也存在组织特有功能蛋白。

该研究开发的mRACE全新细胞特异性线粒体分离技术，以及PolyAn链霉亲和素玻片填补了单线粒体原位分离观测的技术空白，弥补传统线粒体批量提取无法区分细胞来源的缺陷，可广泛用于动植物、线虫等多模式生物线粒体异质性研究。同时，mRACE为作物抗逆、光合改良相关线粒体功能研究提供工具；线粒体细胞特异性编辑与代谢数据，为解析植物气孔发育、高光效育种、逆境能量调控提供新靶点。

原文链接

https://doi.org/10.1111/ppl.70579