直播回顾 | 高压冷冻及冷冻替代技术实践与经验

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随着生命科学研究的进展，大家对细胞超微结构的研究越来越深入，对电镜图像的要求越来越高。传统的化学固定制样方法会产生细胞结构的收缩，细胞内容物的抽提等结构假象，从而丢失了细胞结构的高分辨信息。

高压冷冻制样可以瞬时将样品冷冻，冷冻替代技术是在低温下缓慢的将样品中的水份替代掉，高压冷冻结合冷冻替代技术保存了样品最原始的超微结构信息和高分辨信息。本报告将介绍一下高压冷冻及冷冻替代技术的操作要领及实践经验。

常海双

常海双，上海交通大学医学院高级实验师，上海精准医学研究院电镜平台技术主管。

负责上海精准医学研究院电镜平台的电镜常规TEM制样，高压冷冻制样，冷冻替代，超薄切片，冷冻超薄切片，光电联用，免疫电镜等技术，在电镜制样方面有丰富的实验经验，尤其在高压冷冻制样方面有丰富的经验。支撑相关研究组在Immunity, Nature Microbiology, Nature communication, PNAS等期刊上发表论文多篇。 

高压冷冻技术主要是利用高压（2,100 bar以上）液氮进行毫秒级别快速冷冻，将200um厚的样品迅速凝结成玻璃态。玻璃态的样品内部水分呈非晶态的固态，体积与密度都与液态水相同，因此生物的超微结构能够很好地被保存下来。

高压冷冻制样是重要的电镜生物制样技术，后续实验既可以通过冷冻替代技术用有机溶剂在低温下缓慢的将样品中的水份替代掉，缓慢回到常温，然后经过树脂渗透、包埋聚合、超薄切片、二次染色，进行常温透射电镜的观察；也可以直接将高压冷冻的样品进行冷冻超薄切片，再使用冷冻透射电镜进行观察；还可以帮助实现光电联用、冷冻光电联用等多种电镜技术路线。高压冷冻制样能否成功，对实验人员的操作细节及实验经验有较高的要求。

常老师具有非常丰富的高压冷冻制样的经验，讲座内容非常丰富。首先介绍了为什么要使用高压冷冻技术制样、高压冷冻的制样流程，对比了与化学固定相比的优势。高压冷冻固定得到的图片对样品超微结构保存得更真实也更清晰。

根据样品的不同种类，常老师细讲了贴壁细胞、悬浮样品及组织样品的取样、装载方法。还详细介绍了不同的冷冻保护填充剂的应用特点。

列举了不同实验目的适用的不同配方的冷冻替代液和替代方法，并展示了不同替代液的替代效果。

还提到了适合做免疫胶体金颗粒的标记的替代液配方并展示了精美的免疫电镜效果图片。