胰腺癌基础研究新突破！首次揭示CLK1-SRSF5轴的作用机制及预后价值

胰腺癌是世界上第四大癌症相关死亡原因，通常诊断时已处于晚期。预计到2030年胰腺癌死亡率将位居第二位。尽管对胰腺的研究已经发现了大量关键基因的改变，但是胰腺癌的发病机制仍有很多有待发现。

2021年4月，福建医科大学和瑞金医院的研究团队在BMC杂志社旗下的王牌期刊之一《Journal of Hematology & Oncology》，属于医学1区（中科院1区，JCR1区），2021年即时影响因子突破16.57，发表题为“CLK1/SRSF5 pathway induces aberrant exon skipping of METTL14 and Cyclin L2 and promotes growth and metastasis of pancreatic cance.”的研究，首次在国际上揭示了CLK1-SRSF5轴会促进胰腺癌的发生发展，并明确了CLK1-SRSF5轴对下游可变剪接事件调控的机制及各自参与的经典通路，完善了可变剪接通路理论。

对15对配对的PDAC和胰腺正常组织组成的标本中进行高通量测序。CLK1被鉴定为唯一一个剪接相关的过表达基因，并被选择用于后续实验。CLK1在大多数PDAC组织中显示出比正常组织更高水平的转录物。来自GEO和TCGA数据库的结果也证实了CLK1在PDAC组织中的表达更多。此外，CLK1 mRNA和蛋白质的进一步定量显示，胰腺癌组织的CLK1表达水平高于邻近的非肿瘤组织。

此外，与正常人胰管上皮细胞(HPDE)细胞相比，人胰腺癌细胞系包括PANC-1，8988，Aspc-1，SW1990，BxPC-3具有更多的CLK1蛋白表达。

为了进一步评估CLK1的表达与胰腺癌临床病理特征之间的关系，使用IHC测定了186例患者石蜡包埋的胰腺癌标本中CLK1蛋白的表达，肿瘤组织的CLK1表达显著高于正常组织，CLK1表达增加与肿瘤大小、淋巴转移和TNM分期有关，肿瘤中较高的CLK1表达预示着PDAC患者预后较差。在瑞金医院的另一组患者的外部验证中也获得了类似的结果。综上所述，这些结果表明胰腺癌中CLK1表达升高与PDAC病患者预后不良相关。

• 体外实验
  

为了检查改变的CLK1表达对胰腺癌生长的影响，选择CLK1高表达水平的PANC-1细胞和CLK1低表达水平的BxPC-3细胞。BxPC-3细胞和8988细胞中CLK1表达的增加显著促进了细胞增殖，而PANC-1细胞和8988细胞中CLK1表达的减少显著抑制了细胞增殖。CLK1对细胞增殖的主要作用与细胞周期的扰动有关。

• 体内实验

评估了操纵的CLK1表达对体内胰腺癌细胞生长的影响。与体外结果一致，具有高CLK1表达水平的异种移植物肿瘤比对照异种移植物生长更快，而CLK1表达下调的异种移植物比对照异种移植物生长更慢。当CLK1在异种移植肿瘤中过表达时，p53和p21的表达被抑制。

总的来说，我们的结果表明CLK1通过促进胰腺癌细胞在体外和体内的增殖而作为致癌因子发挥作用。

• 体外实验

为了研究CLK1在PDAC转移中的作用，我们使用稳定过表达或敲除CLK1的PC细胞系进行迁移和侵袭试验。Transwell实验结果表明，BxPC-3细胞和8988细胞中CLK1表达的升高显著促进了细胞迁移和侵袭，而PANC-1细胞和8988细胞中CLK1表达的降低显示了相反的效果。

在伤口愈合试验中观察到类似的结果，这表明CLK1的表达与BxPC-3细胞、PANC-1细胞和8988细胞在体外的迁移和侵袭能力明显正相关，对细胞形态和上皮间质转化的具有影响。

• 体内实验

为了探讨CLK1表达改变对体内PC细胞侵袭和转移过程的影响，将CLK1过表达的BxPC-3细胞或CLK1敲除的PANC-1细胞和相应的对照细胞注射到裸鼠体内以追踪其转移。注射CLK1过表达细胞的小鼠表现出增强的肺转移，更多的转移性结节，而当接种CLK1敲除细胞时观察到受损的肺转移，表现出相反的效果。此外，我们还发现在异种移植的BxPC-3肿瘤中CLK1过表达的小鼠整体存活率降低，而在异种移植的PANC-1肿瘤中CLK1缺失的小鼠显示出延长的存活率。因此，我们的结果表明CLK1的表达促进了人胰腺癌细胞的体内外转移能力。

为了探索CLK1在胰腺癌进展中的潜在机制，我们首先确定了分化的CLK1表达对全基因表达水平的总体影响。进一步的GO和KEGG分析证实，CLK1调控中差异表达的基因主要参与细胞周期的调控。磷酸化蛋白质组学（由吉凯基因提供技术服务）的GO分析表明，CLK1主要调节mRNA选择性剪接相关蛋白质的磷酸化状态。共免疫沉淀(Co-IP)实验和免疫荧光显微照相实验证明了CLK1和SRSF5存在相互作用，表明CLK1可能通过蛋白质相互作用调节SRSF5的磷酸化。

此外，我们进一步验证了CLK1表达与SRSF5 250Ser磷酸化之间存在显著的正相关性。CLK1和SRSF5高表达组的存活率最差，而低表达组的存活率最好。

总之，结果表明CLK1广泛参与磷酸化调节选择性剪接相关蛋白，其中SRSF5的丝氨酸250位点可能是CLK1潜在的重要靶点。

为了探索SRSF5 Ser 250上的磷酸化在调节PDAC细胞恶性行为中的作用，在250-Ser位点突变(S250MU)、在250-Ser位点模拟磷酸化(S250P)和野生型的SRSF5 (S250WT)。集落形成、跨孔实验和CCK-8增殖、细胞计数测定揭示了过度表达的SRSF5^250w，而不是SRSF5^250m，促进了PANC-1细胞的细胞增殖和迁移，而TG003处理则逆转这一趋势。有趣的是，过度表达的SRSF5^250w在BxPC-3细胞中没有表现出类似的能力，而过度表达的SRSF5^250P促进了BxPC-3细胞的增殖和转移。

考虑到这种差异可能是由不同的CLK1表达引起的，我们进一步评估了在CLK1表达存在或不存在的情况下SRSF5的功能。CLK1沉默显著损害了SRSF5-WT的促生功能，而SRSF5-250P的过表达显示出即使在CLK1沉默后也能促进PANC-1细胞的增殖和转移的强大能力。敲除SRSF5削弱CLK1的促癌功能。在PANC-1细胞和BxPC-3细胞中，SRSF5的磷酸化似乎是CLK1调节EMT途径和细胞周期途径的主要原因。

为了评估体内SRSF5^Ser250磷酸化的效果，在异种移植动物模型中，CLK1沉默后，SRSF5^Ser250P表达上调的异种移植物比SRSF5^Ser250WT或SRSF5^Ser250M表达上调的其他组生长更快，更强的肺转移信号，存活时间更短。因此，我们的结果表明CLK1介导SRSF5 ^Ser250磷酸化，是CLK1在胰腺癌中促癌基因功能的潜在机制。

为了全面了解CLK1介导的SRSF5上Ser250磷酸化对选择性剪接事件(AS)的调节能力，我们在两组胰腺癌细胞中进行了转录组（由吉凯基因提供技术服务）测序。A组包括用对照慢病毒(Lenti-CTRL)或CLK1-表达干扰的慢病毒(sh-CLK1)感染的PANC-1细胞，而B组包括稳定表达野生型SRSF5 (SRSF5WT)或突变型SRSF5 (SRSF250m)的PANC-1细胞。A组的564个基因和4978个不同的AS事件，以及B组的659个基因和4767个不同的AS事件发生改变，其中外显子跳跃是两组中最常见的AS事件，其中METTL14的外显子10跳跃得到高PSI，而Cyclin L2的外显子6.3跳跃在两组中得到低PSI。CLK1敲除促进Cyclin L2外显子6.3的跳过，同时抑制METTL14外显子10的跳过，而CLK1表达的增加显示相反的效果。综上所述，CLK1对SRSF5上Ser250的磷酸化促进了SRSF5与METTL14和Cyclin L2的前mRNA之间的相互作用以及随后的外显子跳跃的调节。

考虑到METTL14主要参与调节m6A，首先探讨了CLK1-SRSF5轴在调节PANC-1细胞m6A水平中的作用。SRSF5-WT和SRSF5-P的过表达显著增加m6A水平。与METTL14-S和对照组相比，METTL14-L诱导m6A水平升高。总之，胰腺癌细胞中m6A水平的升高和CLK1-SRSF5轴的促癌作用依赖于抑制METTL14^△exon10+跳过。

Cyclin L2在许多类型的癌症中调节细胞周期和增殖。为了探讨可变剪切事件（AS）对Cyclin L2功能的影响。与对照细胞相比，过表达的CyclinL2^{△exon6.3−}(CCNL 2-L)促进了集落形成和细胞增殖。CyclinL2^△exon6.3+ (CCNL2-S)促进PDAC细胞的迁移和侵袭。推测CLK1-SRSF5轴的促增殖作用至少部分依赖于Cyclin L2外显子6.3的跳过，这强烈促进增殖同时抑制PC细胞的转移。

为了进一步阐明METTL14/Cyclin L2选择性剪接与胰腺癌患者临床预后之间的关系， PCR评估了52对PDAC样本中METTL14^△exon10和  CyclinL2^△exon6.3的剪接百分比指数(PSI)。结果显示，在PDAC肿瘤样本中，METTL14^△exon10的PSI升高，而CyclinL2^△exon6.3的PSI降低。METTL14^△exon10的高PSI与淋巴转移呈正相关，而CyclinL2^△exon6.3的高PSI与肿瘤大小呈正相关或负相关。总体生存率对于高PSI的METTL14^△exon10或低PSI的CyclinL2^△exon6.3的患者明显更低。因此，METTL14和CyclinL2的异常选择性剪接对PDAC患者有潜在的预后价值。

首次系统评估了CLK1-SRSF5轴在胰腺癌发展中的作用以及该途径的预后价值。从机理上讲，证明了CLK1-SRSF5轴通过促进的Cyclin L2外显子6.3的跳跃促进胰腺癌的增殖，并通过抑制METTL14外显子10的跳跃增强细胞的迁移和侵袭能力。首次展示了CLK1-SRSF5轴通过影响METL 14△外显子10的选择性剪接模式来调节胰腺癌m6A甲基化。首个报道m6A修饰相关蛋白的选择性剪接模式转变。

备注：此项研究中的转录组和磷酸化修饰组由吉凯基因提供技术服务。