鸭绒及鹅绒制品采用荧光PCR鉴定方法

  　羽绒是指生长在鹅、鸭腹部呈芦花朵状的绒毛，是一种动物性蛋白质纤维，在羽绒、棉花、羊毛和蚕丝四大天然保暖材料中，羽绒的保暖性能最佳[1]。然而，目前市场上的羽绒制品价格高低悬殊，存在不少羽绒制品掺假造假现象[2-3]，现阶段，羽绒市场存在用劣质原料冒充、标示的充绒量与实际不符、蓬松度不合格、清洁度不合格等问题[4]，其中常见的用劣质原料冒充的方式有：用腈纶棉制成的假羽绒制品、用原毛制作羽绒制品、用粉碎绒(飞丝)制作的羽绒制品[5]。

　　在检测行业中，羽绒的鉴定主要依据国家标准gb/t 10288—2003《羽绒羽毛检验方法》及行业标准fz/t 80001—2002《水洗羽毛羽绒试验方法》提供的方法，该方法是通过光学显微镜，用肉眼观察样品的显微结构，并对比标准中关于鸭绒、鹅绒及其它鸟类绒毛显微特征的文字描述和图示进行归类鉴定。该方法对检验人员要求高、主观性大，容易产生误判，使用的示意图和文字描述简单，缺乏实物标样参照，给实际检验工作带来困难[6]。

　　有鉴于此，本研究开发了鸭绒及鹅绒制品的荧光pcr鉴定方法，以期与传统鉴定方法相结合，提高羽绒鉴定的客观性和准确度。

　　2 材料和方法

　　2.1 材料与试剂

　　2.1.1 试验材料

　　试验所用的鸭绒、鹅绒等制品来自市场购买。

　　2.1.2 试剂

　　异硫氰酸胍、聚乙烯基吡咯烷酮k-40(pvp k-40)、十二烷基硫酸钠(sds)、β-巯基乙醇为amersco公司产品，鲑精dna为sigma公司产品，taq酶及2×premix extaq酶购自宝生物工程(大连)有限公司，引物及探针(表1)由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　2.2 方法

　　2.2.1 dna提取

　　挑取带毛囊的羽绒，剪取毛囊部位约0.03g样品，加入3ml 2% sds溶液[2% sds，50mmol/l tris·cl(ph值8.0)，20mmol/l edta(ph值8.0)]，65℃水浴1.5h，不时振荡;12000r/min离心5min，取上清;加入3ml羊毛提取液[4mol/l异硫氰酸胍，0.3mol/l氯化钠，4% pvpk-40，50mmol/l tris·cl(ph值8.0)，20mmol/l edta(ph值8.0)]及60μlβ-巯基乙醇，65℃水浴4.5h，不时振荡;12000r/min离心5min，取上清，加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000r/min离心10min;取上清，加入1μl 10mg/ml鲑精dna，1/10体积的3mol/l乙酸钠(ph值5.2)及等体积异丙醇，-20℃沉淀过夜，12000r/min离心15min收集沉淀;小心倒去上清，用70%乙醇洗涤二次，风干;取50μl去离子水溶解沉淀。

　　2.2.2 荧光pcr检测体系建立

　　2.2.2.1 鸭绒、鹅绒特异性荧光引物设计

　　根据家鸭、番鸭、斑嘴鸭、家鹅、鸿雁、鸡、家鸽、鹌鹑、北美火鸡的线粒体12s rdna全基因序列设计引物和探针，在考虑引物及探针特异性的基础上，保证在引物和探针结合位点处，家鸭与其祖先种绿头鸭及斑嘴鸭序列一致，家鹅与其祖先种鸿雁序列一致。

　　2.2.2.2 荧光pcr扩增及结果判断

　　反应体系(20μl)：2×premix ex taq 10μl，上下游引物各0.2μmol/l，探针为0.1μmol/l，模板dna为4μl。反应程序：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 34s，40个循环。结果判断：ct值≤35时，可判定结果为阳性;ct值>35时，可判定结果为阴性。

　　2.2.2.3 方法特异性和检出限试验

　　以提取的家鸭、番鸭、鸭绒、鹅、鹅绒、鸡、鹌鹑、家牛、水牛、猪、绵羊、山羊、马、兔、小白鼠、鲑精dna为扩增模板，使用鸭绒、鹅绒特异性引物和探针进行荧光pcr反应，以验证方法的特异性;并以100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg的模板进行荧光pcr反应，以检测方法的检出限，每个梯度做三个平行。

 2.2.3 样品检测

　　选取18个鸭绒制品，按1.2.1的步骤提取dna，按2.2.2进行荧光pcr反应，所使用的样品见表2。由于鹅绒制品较稀少，在市面上购买不到鹅绒制品，样品试验中不包含鹅绒制品。

　　3 结果

　　3.1 鸭绒及鹅绒制品dna提取方法的建立由于鸭绒及鹅绒制品含肉眼可见明显毛囊，试验中剪取鸭绒及鹅绒毛囊部位，使用sds-异硫氰酸胍-β-疏基乙醇法[7]提取鸭绒及鹅绒dna。所提取的dna浓度达20ng～200ng，进行荧光pcr反应时鸭绒dna及鹅绒dna的ct值分别为25和26(图1)，表明使用该方法提取的dna质量满足荧光pcr要求。

　　3.2 方法特异性试验结果

　　结果，鸭绒特异性荧光引物仅能扩增家鸭、番鸭及鸭绒dna，与其它物种dna无非特异性扩增;鹅绒特异性荧光引物仅能扩增家鹅及鹅绒dna，与其它物种dna无非特异性扩增，表明所设计的引物特异性好。

　　3.3 方法检出限试验结果

　　结果，使用本方法提取100%鸭绒原料及100%鹅绒原料dna进行荧光pcr反应时dna检出限为10ng(含鲑精dna)。

　　3.4 样品检测试验结果

　　检测结果表明18个鸭绒样品均可检出鸭dna成分，未检出鹅dna成分，检测结果与产品的明示成分一致(表1)。单独使用家鸭特异性引物及番鸭特异性引物进行荧光pcr反应，18个样品均检出家鸭dna成分，未检出番鸭dna成分，表明18个鸭绒制品均来自家鸭绒。

　　4 讨论

　　动物纤维中的dna主要存在于毛囊部位，在毛干中也存有少量线粒体dna[8]，由于羽绒制品含有肉眼可见的毛囊，试验过程中重点挑取毛囊部位，使用sds-异硫氢酸胍-β-巯基乙醇dna提取法[7]进行dna提取时，羽绒毛囊部位基本溶解，毛干产生大范围断裂，通过样品检测试验，表明该方法可成功提取鸭绒及鹅绒dna。

　　本试验选取线粒体16s rdna基因序列作为引物设计靶位点，引物设计时，必须考虑所设计的引物可涵盖全世界不同鸭鹅品系。理论上，由于鸭、鹅与其祖先种的分化时间久于鸭、鹅各品系分化时间，只要某段dna序列在鸭鹅及其祖先种中保守，则可保证在所有的驯化品系中保守，从而在理论上保证该引物可检测所有鸭鹅品系的羽绒制品。根据维基百科和相关文献的报道[9-10]，除疣鼻栖鸭(cairina moschata，俗称番鸭)外，家鸭起源于河鸭属中的绿头野鸭(anas platyrhynchos)和斑嘴鸭(a. poecilorhyncha)，而番鸭是由中南美洲引入的鸭种。家鹅是由雁类野鸟经人类长期驯化形成，其中中国家鹅由鸿雁(anser cygnoides)驯化而成，欧洲家鹅由灰雁(a.anser)驯化而成。因而，下载家鸭、番鸭、家鹅与其祖先种，同时下载相近品种进行引物设计，所设计的引物通过ncbi数据库blast比对以及特异性试验，表明特异性好。

　　羽绒纤维种类的鉴定目前主要依靠显微镜法，该方法操作简单，但过分依赖试验人员的素质和经验，主观性过强，本研究开发的方法可作为传统显微镜鉴定方法的有力辅助，进一步提高羽绒鉴定的客观性和准确性。