Mol Cell | 蛋白+代谢揭示卵细胞成熟机制

生殖与机体的代谢状态密切相关。好的新陈代谢是产生优质卵子的必要条件。然而，卵母细胞发育的代谢谱仍然不清楚。本文研究者通过分离大量关键阶段的细胞，获得了小鼠卵母细胞在体内成熟过程中的动态代谢谱。与此同时，研究者做了定量蛋白质组学，从协同的角度描述卵母细胞的整体代谢模式。本文数据为探索卵母细胞代谢提供了广泛的资源，并为发现预测和改善卵母细胞质量和女性生育能力的生物标志物提供了机会。

小鼠卵母细胞成熟的代谢组学和蛋白质组学分析

虽然体外卵母细胞代谢的变化已被报道，但在体内卵母细胞成熟过程中代谢动力学的全面研究还缺乏。这在很大程度上是由于实验材料数量有限。卵母细胞是雌性哺乳动物中最大的细胞，但与体细胞相比数量非常少。这里,我们在小鼠卵母细胞减数分裂成熟三个关键时间点隔离大量的小鼠卵细胞，使用 UHPLC-HRMS检测代谢物。通过t检验(p < 0.05)和变量重要性预测(VIP >1.00)分析，共鉴定出57个差异代谢物。正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)表明，三个阶段的卵母细胞组代谢物组成不同 (图1C-1E)。减数分裂成熟过程中代谢物水平的变化表现为热图(图1F)。KEGG描述了不同的代谢组学图谱对应各自的生化途径，揭示了不同的代谢产物模式(图1F)。一般来说，氨基酸/碳水化合物/核苷酸在减数分裂恢复、GV到GVBD、或GV到MII期间增加，而脂类代谢产物在减数分裂恢复期间显著减少(图1F-1H)。

代谢酶是细胞代谢的媒介。为了确定底物/产物的变化是否与相应的酶蛋白积累变化相关，我们同时对GV、GVBD和MII卵母细胞进行了蛋白质组学定量分析。检测到46016个多肽，定量了4694个蛋白，共鉴定出2081个差异水平的蛋白。GO分析显示，与代谢通路相关的类别显著丰富，如谷胱甘肽/碳/丙酮酸代谢和三羧酸循环(TCA循环)。为了更好地理解卵母细胞发育中的代谢参与，我们还将所有有差异积累的酶定位到主要的KEGG代谢途径，揭示了在减数分裂成熟过程中氧化磷酸化/维生素代谢等通路显著改变。

■ ■■■■

图1.

卵细胞发育过程代谢物变化

本文就检测到的代谢物情况做了总结。在卵母细胞成熟过程中有两种不同的脂质代谢模式。与未成熟的GV卵母细胞相比，减数分裂恢复时的肉碱和棕榈酰肉碱水平显著升高(图2A和2B)。脂肪酸在小鼠卵母细胞成熟过程中的利用增强。卵母细胞成熟过程中胆汁酸及其衍生物减少。多不饱和脂肪酸花生四烯酸(ARA)、二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)的水平在减数分裂恢复期间下降。卵母细胞成熟过程中氨基酸代谢具有不同模式。大多数氨基酸(如丝氨酸、谷氨酸和组氨酸)的丰度在减数分裂恢复期间显著增加，然后在成熟的卵母细胞中减少(图4A-4H)。相比之下，一些氨基酸(即甘氨酸和降缬氨酸)从GV到MII阶段持续增加(图4I和4J)。其他氨基酸(如乙酰丙酸、胱氨酸和次牛磺酸)的水平在减数分裂恢复期间下降。氨基酸也是核苷酸和脂类合成、碳氮平衡和氧化还原缓冲的中间体。因此，卵母细胞代谢趋势的多样性反映了氨基酸代谢调控的复杂性和微调性。减数分裂恢复过程中丝氨酸-甘氨酸-单碳途径上调。研究发现，在减数分裂恢复期间，蛋氨酸循环中的大量代谢物升高(图4K)。在卵母细胞成熟期间，碳水化合物代谢物的数量增加(图6A-6H)，主要富集于TCA循环和戊糖磷酸途径。在减数分裂成熟过程中，7个核苷酸相关代谢产物的丰度增加(图7A-7K)，IMP增加了14倍，胞苷增加了5倍。

■ ■■■■

图 2.

ARA抑制促进减数分裂成熟的靶点的鉴定

为了阐明花生四烯酸（ARA）水平降低促进卵母细胞成熟的潜在机制，我们对在含ARA和不含ARA的培养基中培养7 h的卵母细胞进行了蛋白质组学比较分析(图3A)。经ARA处理的卵母细胞共检测到35344个多肽，其中3787个蛋白的积累发生了显著变化(FDR = 0.05, Log2 fc >1.5;图3B及3C)。GO分析表明，许多不同积累的蛋白在减数分裂、细胞周期和RNA处理过程中富集(图3D)。其中，差异蛋白NFKB激活蛋白(NKAP)和B细胞转位基因4 (BTG4)值得关注。NKAP是一种高度保守的蛋白，在有丝分裂和转录调节中发挥作用。BTG4作为调节母体mRNA稳定性的重要因子，在正常卵母细胞成熟过程中急剧增加。

ARA通过控制NKAP的积累来调节卵母细胞的减数分裂过程

我们首先验证了蛋白质组学数据，通过western blot分析显示ARA处理后的卵母细胞NKAP水平降低了70%(图3E)。免疫染色显示NKAP存在于GV卵母细胞的胞浆和细胞核中。一旦卵母细胞恢复减数分裂，NKAP就会集中在纺锤体区域(图3F)，表明它可能在减数分裂过程中发挥作用。为了测试这种可能性，在完全成熟的卵母细胞中注入NKAP small interfering RNA(siNkap)，导致NKAP蛋白显著降低。在NKAP缺失的卵母细胞中，很容易发现纺锤体解体和染色体聚集失败，这与ARA处理的卵母细胞的表型类似。

■ ■■■■

图 3 . 

■ ■■■■

图 4 . 

ARA在减数分裂成熟过程中影响BTG4控制的mRNA降解

BTG4已被证明在减数分裂成熟过程中通过刺激mRNA的poly(A)尾巴的去烯酰化来触发卵母细胞mRNA的衰变。与蛋白组数据类似，western blotting显示ARA处理的卵母细胞中BTG4水平相对于对照组降低了80%(图3L)。使用PAT试验评估了卵母细胞中几种代表性转录本(Padi6、Nobox、ZP2和Fgf8)的多聚腺苷化水平。与之前的报道(Yu et al.， 2016)一致，poly(A)尾巴在成熟的卵母细胞中缩短，但值得注意的是，在ARA处理的卵母细胞中，这一过程被阻断(图3N-3R)。这些数据表明，在减数分裂恢复过程中ARA的下降允许BTG4积累，引发母体RNA的退化。

SHMT2缺失会损害成熟卵母细胞的表观遗传学

丝氨酸通过丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT1/2)进入SGOC通路的核心，该酶将丝氨酸(三个碳)转化为甘氨酸(两个碳)，将一个碳转化为四氢叶酸(THF)(图4K)。缺乏SHMT1的小鼠没有明显的表型，而SHMT2缺失是胚胎死亡，这表明线粒体SHMT2可能更重要，从而弥补细胞质SHMT1缺失。为了研究SGOC代谢在卵母细胞发育中的作用，我们进行了SHMT2基因敲除实验(图5A)。内源性SHMT2蛋白被小干扰RNA (siRNA)注射有效地消耗(图5B)。我们发现，与对照相比，在敲除组中丝氨酸/甘氨酸比例增加 (图5C)。值得注意的是，SAM水平显著降低(图5D)，这与SGOC通路活性在siShmt2卵母细胞中减弱一致。在受精后，只有30%来自Shmt2敲除卵母细胞的胚胎在第1.5天发育为2细胞期，这明显低于对照组(图5F和5G)，反映了卵母细胞发育潜能受损。

■ ■■■■

图5.

■ ■■■■

图6.

 卵母细胞成熟过程中核苷酸代谢的渐进性增加

在减数分裂成熟过程中，7个核苷酸相关代谢物增加。蛋白质组学和代谢途径的综合分析显示，参与核苷酸代谢的23种酶中的17种水平升高(图7L-7P)。例如，在成熟的卵母细胞中，嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)，升高3- 6倍(图7L)，二氢旋转脱氢酶(DHODH)，升高2倍。研究者还观察到肌苷和黄嘌呤水平在卵母细胞成熟过程中显著下降(图7I和7J)。这些数据表明核苷酸代谢途径是调节减数分裂成熟机制的重要参与者。

■ ■■■■

图7.

我就知道你“在看”