Microbiome | 首次发现抗生素调控肠道细菌与真菌的相互作用机制

背景：抗生素处理对肠道细菌组成具有公认的有害作用，但对真菌组成的作用尚不清楚。胃肠道内腔中的细菌可能会限制真菌的定植和侵袭。因此，针对细菌的抗生素药物被视为真菌感染和诱发过敏的重要危险因素。但是，尚未在人类中研究抗生素对肠道细菌-真菌相互作用的影响，包括破坏和恢复真菌群落组成。收集14位健康人连续6天服用抗生素之后的3个月内的粪便样本，进行宏基因组学，宏转录组学，代谢组学和真菌ITS2测序。

结果：细菌群落在抗生素处理后3个月基本恢复，而真菌组成从共生关系转变为竞争关系。抗生素处理前存在的细菌-真菌互作，其中一半在3个月后消失。抗生素处理期间，真菌的丰度与细菌中细胞生长和修复功能的基因表达相关。细菌菌株可抑制机会致病性白色念珠菌生长，而白色念珠菌的致病性和宿主细胞损伤可被细菌代谢物（如丙酸和5-十二碳酸）调控。

结论：证明了抗生素药物对人体肠道菌群有长期影响。细菌群落在抗生素处理后30天大部分恢复，而真菌群落则从共生转向竞争关系。

抗生素对真菌的影响

宏基因组和宏转录组结果

宏基因组结果显示，抗生素处理期间DT样本中细菌科水平α多样性降低，宏转录组结果显示无显著差异。DNA水平（宏基因组）和RNA水平（宏转录组）功能丰度在处理组间差异显著。宏基因组显示，抗生素处理组特定代谢通路的α多样性显著降低，宏转录组无显著变化。进一步分析了单个细菌对代谢途径的贡献在两个时间点之间是否发生了显著变化，发现9种细菌的贡献发生了显著变化，重要的肠道共生细菌（包括Akkermansia muciniphila，Faecalibacterium prausnitzii，Odoribacter splanchnicus和 Bifidobacterium adolescentis）的贡献减少，多重耐药菌Clostridium bolteae贡献增大。与宏基因组相比，基因表达的变化要少得多，而且不同个体之间的一致性较差，抗生素处理对核心和可变代谢途径的转录活性没有明显影响，宏转录组比宏基因组更具动态变化。

宏基因组和宏转录组结果

抗生素处理对细菌-真菌互作的影响

基于细菌和真菌种水平丰度构建网络图，处理期间DT样本的节点连接度（node degree）与处理前baseline样本相比增加，从DT到处理后早期，EPT节点连接度下降，在处理后晚期LPT进一步下降。基于这些结果以及在真菌网络中观察到的相关性的丧失，可以得出结论，抗生素处理是细菌-真菌相互作用紊乱的触发事件， 这些干扰最终驱使肠道细菌和真菌走向独立。处理前baseline样本中，约有三分之一的关系对和白色念珠菌相关，三分之一和酵母相关。处理后，节点连接度显著下降，在处理后90天，白色念珠菌的共表达模式消失了，而酵母属占相关性的70％以上（24 /31）。总体而言，酵母在细菌代谢途径表达方面比其他真菌适应性更强。

基于代谢通路表达水平与真菌OTU丰度构建网络图，处理期间DT样本的节点连接度（node degree）与处理前baseline样本相比增加，大多数呈正相关（146/189），表明真菌群落和细菌代谢通路表达之间存在相互影响，其中核苷酸代谢和生物合成代谢通路节点显著增加，处理后除次级代谢通路外所有通路节点显著下降。抗生素处理期间，真菌的丰度与细菌中细胞生长和修复功能的基因表达相关。

抗生素处理对细菌-真菌互作的影响

影响白色念珠菌定植的关键代谢物及细菌

对15个粪便样本进行代谢组学分析，基于代谢物相对丰度与白色念珠菌相对丰度计算Spearman相关性，选择相关性大的代谢物添加到培养基中进行白色念珠菌生长试验。包括4-羟基苯甲酸和8,11,14-二十碳三烯酸在内的几种代谢物，最大浓度下仅引起较小生长抑制。己二酸，氨基己二酸和鸟氨酸产生了更显著的生长抑制，但是在这些代谢物高浓度下，真菌仍然生长，丙酸，乙酸和顺式5-十二碳烯酸在一定浓度范围内完全抑制了真菌生长。使用不带白色念珠菌的人阴道细胞系（A431），石胆酸（LCA）和顺式-5-十二碳烯酸显示出有限的细胞毒性，没有其他物质引起可检测的细胞损伤，乙酸或顺式5-十二碳烯酸几乎完全消除了白色念珠菌对细胞的损伤，苯甲酸降低了损害程度。由于形态（酵母或菌丝细胞）对其破坏潜力至关重要，对这些物质是否还导致白色念珠菌的形态变化进行研究。在高浓度下，5-十二碳烯酸和乙酸几乎完全抑制了菌丝的形成和生长，在允许生长的浓度下，5-十二碳酸酯也减少了菌丝的形成， LCA在高浓度下会部分抑制菌丝形成。这些抑制白色念珠菌生长的代谢物也可能促进真菌竞争菌群的生长，进行相关性分析发现对白色念珠菌有抑制作用的代谢物，只有2-甲基丁酸和3-羟基丁酸与青霉菌，LCA与黄曲霉呈显著正相关。

将代谢物相对丰度与细菌丰度进行关联分析，选择与白色念珠菌显著正相关且注释到菌株水平的Bacteroides eggerthii和Odoribacter splanchnicus进行体外实验，在改良GAM培养基（mGAM）中添加100%或50%稀释的选定细菌的培养液上清，测定白色念珠菌的生长，白色念珠菌的生长被B. eggerthii（50%）或O. splanchnicus（40%）的上清液显著抑制，使用100％的细菌上清液具有更强的作用，表明抑制作用与上清液浓度成正比，B. eggerthii和O. splanchnicus共培养上清液也可以抑制白色念珠菌的生长。将来自Ruminococcus [Blautia] torques的上清液作为阳性对照（已证明该物种对白色念珠菌的生长具有正效应，且与白色念珠菌呈正相关）进行代谢组检测，发现O. splanchnicus的上清液中含有较高浓度的丁酸（7倍），从而抑制了白色念珠菌的体外生长，生长抑制代谢物己二酸和氨基己二酸以及鸟氨酸的水平升高；B. eggerthii上清液中乙酸（1.6倍），甲酸（3倍）和己酸（2倍）含量升高；B. eggerthii和O. splanchnicus共培养上清液中发现了完全抑制生长的代谢物2-甲基丙酸和丙酸。相比之下，R. torques只有甲酸具有较高的丰度（1.25倍），而几乎没有强抑制性的短链脂肪酸SCFA。总之，上清液代谢组分析表明丙酸，鸟氨酸和苯甲酸是白色念珠菌生长的有效抑制剂，可能由B. eggerthii和O. splanchnicus产生。

影响白色念珠菌定植的关键代谢物及细菌

Antibiotics create a shift from mutualism to competition in human gut communities with a longer-lasting impact on fungi than bacteria. Microbiome. 2020,8:133. 

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