Autophagy | mRNA的核酸修饰影响肥胖进展

●3T3-L1细胞（成纤维细胞3T3-L1是来源于鼠的前脂肪细胞的细胞株，是国际上公认的研究脂肪细胞分化的细胞模型）

●脂肪选择性FTO敲除小鼠（FTO-ako）模型

FTO促进自噬，进一步促进脂肪形成

FTO和ALKBH5是m6A修饰的“擦除器”，是负责去除该修饰的酶，YTH家族蛋白是m6A的“阅读器”-负责识别该修饰的酶，例如本文的研究的YTHDF2蛋白。Western Blot表明，FTO沉默降低了LC3-II：I 比值，增加SQSTM1水平，表明FTO与自噬呈正相关。脂肪细胞标记的mRNA和蛋白水平在FTO过表达细胞中明显升高，用自噬抑制剂3-MA或BafA1处理可将FTO下调至正常水平，表明FTO通过促进自噬促进脂肪细胞分化。

图 1

下调FTO可降低ATG5和ATG7的表达，但不降低ULK1的表达

为了识别自噬过程中FTO的潜在靶基因，我们首先采用qPCR分析比较FTO敲低后自噬相关基因的mRNA表达。最近的一项研究报道，FTO缺失正向调节了293T细胞中ULK1的表达。有趣的是，我们的结果显示，在FTO敲除后，Atg5和Atg7的mRNA水平显著下降，而Ulk1没有变化。同样，FTO的下调显著下调了ATG5和ATG7的蛋白水平。相反，我们发现ULK1等自噬相关蛋白如ATG12、ATG16L1没有发生显著变化。此外,我们检查了ATG5的表达谱和ATG7在脂肪细胞的分化,发现它们在早期阶段增加然后减少,这是类似于FTO的表达模式。这些数据提示Atg5和Atg7可能是我们系统中FTO的靶基因，而不是Ulk1。

图 2

FTO通过靶向ATG5和ATG7影响自噬和脂肪形成

为了证实FTO是否通过影响ATG5和ATG7的表达来影响自噬和脂肪的发生，我们首先验证过表达FTO会显著增加ATG5和ATG7的mRNA水平。沉默ATG5和ATG7可以逆转fto过表达3T3-L1细胞中LC3-II:I的上调，这提示FTO通过调控ATG5和ATG7表达来影响脂肪生成。既往研究报道，在前脂肪细胞中，ATG5和ATG7基因的表达抑制自噬，降低CEBPB水平，并通过抑制PPARG和CEBPA的表达，破坏成脂分化程序的启动。正如预期的那样，我们发现强制表达FTO促进CEBPB蛋白水平，而ATG5和ATG7的缺失则逆转了CEBPB的表达。此外，ATG5和ATG7的下调恢复了FTO过表达促进的3T3-L1细胞的脂肪生成和甘油三酯积累。同样，FTO过表达细胞中Pparg、Fabp4和Cebpa mRNA和蛋白水平的升高也被逆转。总的来说，FTO通过介导Atg5和Atg7影响自噬和脂肪形成。

图 3

FTO对ATG5和ATG7表达的调控依赖于m6A

为阐明FTO在自噬调控中的潜在分子机制，构建了野生型FTO-wt和突变体FTO-mut质粒。用液相色谱串联质谱检测FTO-wt和FTO-mut异位表达对细胞m6A水平的影响。敲低FTO可以增加m6A表达水平。异位表达FTO-WT，而非FTO-MUT或空载体，显著增加了3T3-L1和猪LC3-II:I的表达，提示FTO以去甲基化酶活性依赖的方式调节自噬。与此一致的是，在免疫荧光测定中，表达FTO-WT而非FTO-MUT的细胞显示LC3斑点显著增强。此外，与FTO-MUT或空载体相比，FTO-WT的异位表达增加了自噬体的数量。这些结果表明FTO的去甲基化活性是前脂肪细胞自噬所必需的。

图 4

YTHDF2通过m6a依赖机制介导ATG5和ATG7 mrna的稳定和表达，而不介导ULK1的表达

为了进一步解释m6A甲基化与FTO靶向基因蛋白丰度的负相关关系，我们首先研究了ATG5和ATG7的表达是否受到YTHDF2或YTHDF1的影响。与对照组相比，过表达YTHDF2可显著降低ATG5和ATG7蛋白水平，而ULK1和ATG12无显著变化。相反，强制表达YTHDF1并不影响ATG5和ATG7的表达，提示ATG5和ATG7是YTHDF2的作用靶点。接下来，我们测试了m6A对Atg5和Atg7 mRNA的修饰是否对ythdf2介导的基因调控至关重要。与预期的一样，双荧光素酶检测显示异位YTHDF2显著下调了携带野生型Atg5和Atg7片段的报告者的荧光素酶活性。这种下降完全被m6A共识位点的突变所消除，提示m6A依赖调控。

图 5

脂肪选择性缺失FTO可以减少小鼠的白色脂肪量，抑制ATG5和ATG7依赖的自噬

建立了脂肪选择性FTO敲除小鼠（FTO-ako）模型。与对照组小鼠相比，FTO-ako小鼠脂肪量和体重降低、自噬减弱、ATG5和ATG7蛋白和基因表达减弱。

图 6