恒光讲堂｜红外二区生物荧光成像的临床转化思路：近红外一区花菁染料的再利用（下篇）

2021-03-05 14:21:05, 恒光智影上海恒光智影医疗科技有限公司

上篇链接：恒光讲堂｜红外二区生物荧光成像的临床转化思路：近红外一区花菁染料的再利用（上篇）

本文要点：本文作者系统研究了主发射峰位于近红外一区（NIRⅠ700-900nm）的生物相容性花菁染料的尾发射区域（>1000nm），筛选出的NIR染料在NIR-II区域具有明亮的尾发射，并具有高量子产率、高摩尔消光系数、排泄速度快和适用于生物偶联的官能团，从而可用于多种生物模型NIR-II实时成像，有望促进NIR-II生物成像的临床转化。

对染料进行了NIRⅡ尾发射机理研究后，作者在动物模型上进一步验证他们的设想：以5mg/Kg的剂量给CD-1小鼠静脉注射IR-12N3，几分钟内肝脏便出现强烈的荧光信号，随着时间推移荧光信号出现在肠道，表明了探针具备快速肝胆清除的特性（图3a），尽管IRDye800可以有效通过肾脏清除，皮肤和正常组织对其的高摄取限制了它在血管成像中的有效性。通过对比可以发现，IR-12N3的皮肤和组织摄取比IRDye800低，因此血管成像质量会更高（图3b&c），计算得出的血浆清除半衰期为0.2h（图3d），注射24h后的生物分布实验则显示除肝脏外，其他器官的分布极低，80%以粪便排泄至体外（图3e&f&g），此外小鼠两周内体重变化与对照组无差别（图3h），血象检测结果也显示各血细胞亚型与正常小鼠相比无明显差异，综合以上证明了该探针优异的生物相容性和安全性。

图3：a）小鼠注射IR-12N3后24h内成像图；b）小鼠注射IRDye800后不同时间点成像图；c）IR-12N3不同时间点在肝脏、肠道和皮肤的荧光分布曲线；d）10h内的血浆浓度-时间曲线；e）小鼠粪便的荧光强度-时间曲线；f，g）注射IR-12N3第8h的器官成像图；h）注射IR-12N3两周内小鼠体重变化曲线。

NIRⅡ区域可实现高分辨血管成像，因此作者考察了在不同波长范围下的成像效果，如图4a所示，在不同波长下，越红的波长（1300LP）可以获得更加细微的成像信息，使得血管成像在近红外二区的分辨率大大提高（图4b），而脑血管由于颅骨的存在对成像要求更高，作者随后对小鼠进行无创脑血管成像，如图4c所示，在850-900nm区域几乎看不到任何血管，而使用1300LP后，大脑下静脉、浅静脉、上矢状窦和横窦可被清晰地分辨开来，此外还可以通过实时成像检测小鼠的呼吸速率（图4e）。作者还对比了NIRⅠ区和NIRⅡ区的淋巴结成像，如图4f-h所示，腘淋巴结（图4f）、腘淋巴结和骶淋巴结（图4h）以及腰淋巴结（图4i）在NIRⅠ区和NIRⅡ区成像对比表明了NIRⅡ的分辨率更高，可分辨出相邻淋巴结，而NIRⅠ区却几乎分辨不出。

图4：a）不同NIR II长通滤光片下注射IR-12N3不到2分钟内的成像图；b）在NIR I和NIR II窗口中后肢的荧光截面强度分布图；c）在不同的NIR II长通滤光片上注射IR-12N3后小鼠脑血管成像对比图；d）NIR I / II窗口中脑血管的荧光截面强度分布图；e）录制的脑血管成像视频可用于计算小鼠的呼吸速率；f）在NIR I和NIR II窗口使用IR-12N3进行淋巴结成像；g）NIR I和NIR II窗口中腘淋巴结的横截面强度分布；h）分别在850nm和1200 nm长通滤波片下对腘淋巴结和骶淋巴结淋巴结成像；i）将100μg IR-12N3注入两个脚垫后，在NIR I / II窗口进行腰淋巴结成像；j）NIR I和NIR II窗口中腰淋巴结的荧光横截面强度分布图。

最后作者将IR-12N3通过点击反应与西妥昔单抗偶联，赋予分子肿瘤靶向性，实现了肿瘤靶向成像，如图5c所示为体外细胞靶向实验，鳞状癌细胞（SCC）在800-1000nm下几乎无法分辨，而在1000-1500nm下可以看到探针特异性靶向EGFR表达丰富的癌细胞，随后作者将该探针注射入荷瘤鼠体内，图5d显示了注射后24h，探针在肿瘤区域大量富集，而其他主要器官则几乎没有荧光，在NIRⅠ区和NIRⅡ区成像的肿瘤/正常组织信噪比分别约为4和10（图5f），168h后体外器官成像显示，肿瘤荧光依旧最高（图5g），而对照组探针（IR-FGP）在168h后肿瘤几乎无信号（图5i），其肿瘤/肝脏信号比仅为IR-12N3的1/6（图5j）。综合来看，NIRⅡ区成像相比于NIRⅠ区显示出巨大的优势，然而开发大于1000nm发射的高量子产率的荧光探针依旧面临巨大挑战，尤其是大于1300nm波段，光散射进一步减少从而更加有利于深层组织成像，此外作者认为，“可激活”型探针也同样为目前NIRⅡ区探针起到了补充作用。

图5：a）IR-12N3偶联西妥昔单抗密度梯度离心纯化前与后的荧光成像图；b）IR-12N3偶联西妥昔单抗的凝胶电泳分析；c）NIRⅠ与NIRⅡ窗口下鳞状癌细胞染色成像图；d&e）NIRⅠ与NIRⅡ窗口下对荷瘤鼠不同时间点成像图；f）NIRⅠ与NIRⅡ的不同时间肿瘤/正常组织比直方图；g）168h后肿瘤与肝脏、脾脏和肾脏的荧光成像图；h）不同器官组织荧光强度直方图；i）对照组IR-FGP偶联西妥昔单抗的168h后肿瘤与肝脏、脾脏和肾脏的荧光成像图；j）IR-12N3与IR-FGP偶联单抗后的肿瘤/肝脏比直方图。

参考文献

Zhu, Shoujun, Hu, et al. Repurposing Cyanine NIR-I Dyes Accelerates Clinical Translation of Near-Infrared-II (NIR-II) Bioimaging[J]. Advanced Materials, 2018.

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