微课回顾 | How does stLFR get LFR(含FAQ)

在基因组学研究中，长短片段相结合、多种测序技术齐上阵已成为趋势。而华大智造自主研发的stLFR技术集短片段与长片段优势于一身，拥有强大的性能和广泛的应用场景。

短读长测序有诸多优势，是目前应用最广泛的测序方法。但在组学研究中，也需要长片段构建的基因组图谱、大型结构变异检测、高度同源基因研究、单倍体型分析等信息。

华大智造自主研发的stLFR技术是一项基于高精度短读测序方法获取长片段DNA信息的创新技术。该技术仅需单管操作，从已提取好的长片段DNA起始，将转座子序列随机插入至长片段DNA中，然后利用一段夹板引物将转座子与带有多拷贝分子标签的磁珠载体结合，再引入第二个接头后进行PCR扩增和环化，最终完成文库构建，进行高通量测序。

由于同时兼顾长读长及短读长的测序优势，stLFR不仅能够获取全面的长片段DNA信息（10kb-300kb），还可以通过一次检测获得各种类型的变异信息（包括SNP、InDel、CNV和SV），同时对于高度同源的基因组，也能够获得更好的比对效果。

stLFR技术自面世以来受到用户的广泛欢迎，在临床探索及科学研究中解决了很多实际问题。尤其在肿瘤研究、人人基因组及动植物De novo等领域，能够高效、高质量、低成本升级现有技术平台。

在对肿瘤样本进行RNA测序时发现IRF4 intron5 和BLOC1S5的Exon5存在结构变异，推测chr6上有可能发生倒位，因而想在DNA层面进行验证。由于样本很珍贵，只有ng级别，且样本严重降解，单分子测序技术或纳米孔测序技术对样本起始量要求较高（需要ug级别），对于此类样本往往束手无策。而华大智造的stLFR技术只需1.5ng即可满足建库需求。因此，采用了stLFR技术对其进行验证，而结果也证实：该结构变异确实是由于chr6的398104-8014571位置发生了倒位而引起的。

采用高深度stLFR+低深度ONT技术进行人基因组组装，能够获得高质量高精度的个人基因组数据。目前业内对于人类基因组测序的“金标准”是“676”，指的是序列拼接的contig长度达到10的6次方，序列拼接的scaffold长度达到10的7次方，人类双倍体基因组共6G基因序列能够做到单倍体定相。即：

· Contig N50＞10⁶ bp

· Scaffold N50＞10⁷ bp

· 组装全基因组数据＞6G

近期在bioRxiv上发表的一项研究显示，对比常规的长读长为主、短读长为辅的组装方法，使用stLFR技术为主、长读长为辅的方法也能够获得类似的组装效果，而成本仅为常规方法的五分之一。研究同时对比了不同组装结果的准确性，结果显示使用stLFR技术，indel以及mismatches的错误率均是最低的。因此，在动植物领域，相较于传统方法，使用stLFR技术能够用极低成本获得相同质量数据，且结果更准确。

参考文献：

Comparison of long read methods for sequencing and assembly of a plant genome. 

doi: https://doi.org/10.1101/2020.03.16.992933

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