Molecular Psychiatry：广州脑科医院范妮教授课题组揭示慢性氯胺酮导致认知障碍的分子机制

氯胺酮快速抗抑郁作用的发现，是目前抑郁症治疗领域最重要的进展之一，艾司氯胺酮已被FDA批准用于难治性抑郁症的治疗。近期有研究报道重复氯胺酮治疗有助于预防抑郁症复发，但有多项研究显示慢性氯胺酮使用会导致认知障碍，但其分子机制尚不清楚。

2020年6月2日，广州医科大学附属脑科医院范妮教授课题组在神经精神疾病领域顶级期刊《Molecular Psychiatry》（2019年IF:12.384），发表了题为“Chronic administration of ketamine induces cognitive deterioration by restraining synaptic signaling”的研究论文，阐明了慢性氯胺酮给药引起认知损害的可能机制，并提供潜在的干预靶点。

该研究中，范妮教授团队运用分子生物学、膜片钳电生理记录、双光子显微镜成像，动物行为学等方法，发现慢性氯胺酮通过CaMKIIβ-ERK1/2-CREB/NF-κB信号通路引起的谷氨酸能系统功能减退可能是慢性氯胺酮所致认知功能损害的潜在机制。本研究提出CaMKIIβ为减轻氯胺酮认知损害的可能作用靶点，为扩展氯胺酮抗抑郁治疗的临床应用并避免慢性氯胺酮所致的认知损害提供了可能的新策略。

首先，作者分析慢性氯胺酮引起小鼠海马区域谷氨酸受体表达改变。Western Blotting实验结果表明，慢性氯胺酮（30mg/kg）给药1天、3天、5天、10天后，小鼠海马区域谷氨酸亚单位表达水平无变化（Figure1A, 1B）；慢性氯胺（30mg/kg）给药28天后，小鼠海马区域GluA1、GluA2、GluN2A、GluN2B亚单位表达水平呈剂量依赖的显著降低（Figure1B,1C），此外，在停药后的第28天，这些亚单位表达水平的降低仍持续存在（Figure1D）。进一步分析发现慢性氯胺酮（30mg/kg）给药28天后，小鼠海马区域总蛋白、膜蛋白、细胞内蛋白中的GluA1、GluA2、GluN2A、GluN2B亚单位表达及其磷酸化水平下降（Figure1E, 1F, 1G）。并且这些亚单位的mRNA水平也显著下降（Figure1H）；

Figure1.慢性氯胺酮引起小鼠海马区域谷氨酸受体亚单位呈剂量和时间依赖的持续降低表达

接下来作者分析慢性氯胺酮是否引起小鼠海马区域突触/突触外谷氨酸受体、树突棘密度和突触结构蛋白表达的改变。免疫荧光组织实验结果表明，慢性氯胺酮（30mg/kg）给药28天后，海马CA1区GluA1、GluA2、GluN2A、GluN2B亚单位在突触位点和突触外位点的表达水平下降（Figure2A, 2B）；慢性氯胺酮（30mg/kg）给药28天的EGFP转基因小鼠海马CA1区蘑菇状和瘦长型的树突棘密度降低，总的树突棘密度也降低（Figure2D）。Western Blotting实验结果表明，慢性氯胺酮（30mg/kg）给药28天后，海马区域突触结构蛋白Syn和PSD-95表达水平下降（Figure2E）。此外，在停药后的第28天， Syn和PSD-95表达水平的降低仍持续存在（Figure2F）。

Figure2. 慢性氯胺酮引起海马区域突触/突触外谷氨酸受体、树突棘密度和突触蛋白表达降低

随后，作者分析了慢性氯胺酮引起谷氨酸受体、树突棘密度和突触蛋白改变的可能信号通路，Western Blotting实验结果表明，慢性氯胺酮（30mg/kg）给药28天后，小鼠海马区域CaMKIIβ、ERK1/2、CREB、NF-κB的表达及其磷酸化水平降低（Figure3A），表明这些信号分子可能与慢性氯胺酮引起的谷氨酸受体亚单位表达水平下降有关。进一步分析过表达CaMKIIβ可逆转慢性氯胺酮（30mg/kg）给药28天引起的GluA1、GluA2、GluN2A、GluN2B表达的降低和树突棘密度的降低（Figure3B, 3C）。这些结果进一步表明CaMKIIβ对谷氨酸受体表达和树突棘密度具有重要的作用。

Figure3.过表达CaMKIIβ可逆转慢性氯胺酮引起的谷氨酸受体表达和树突棘密度降低

接下来，作者分析了慢性氯胺酮是否引起小鼠海马CA1区域突触可塑性和突触基本传递的改变。电生理实验结果表明，慢性氯胺酮（30mg/kg）给药28天后，小鼠海马CA1区的LTP(long-term potentiation, 长时程增强)降低；过表达CaMKIIβ可逆转LTP损害（Figure4A）。此外，在停药后的第28天，慢性氯胺酮引起的LTP损害仍持续存在（Figure4B）。进一步分析发现，慢性氯胺酮（30mg/kg）给药28天后，小鼠海马CA1区的基本突触传递功能、突触前膜释放功能、和突触后膜的功能、NMDAR受体功能均降低，过表达CaMKIIβ可逆转慢性氯胺酮引起的这些基础突触传递损害(Figure4C、4D、4E、4F）。

Figure4. 过表达CaMKIIβ可逆转慢性氯胺酮引起的LTP损害和基础突触传递损害

最后，作者分析了慢性氯胺酮是否引起小鼠认知功能改变。水迷宫实验结果表明，慢性氯胺酮（30mg/kg）给药28天后，小鼠到达目标平台的潜伏期显著增加，小鼠穿越目标平台的次数显著降低，过表达CaMKIIβ可逆转慢性氯胺酮引起的这些变化（Figure5B,5C）。这些结果表明慢性氯胺酮引起小鼠学习和记忆损害，过表达CaMKIIβ可逆转这种损害。

Figure5. 过表达CaMKIIβ可逆转慢性氯胺酮引起的学习和记忆损害

1. 慢性氯胺酮给药28天后，小鼠海马区域GluA1、GluA2、GluN2A和GluN2B表达下降，树突棘密度降低，突触结构蛋白Syn和PSD-95表达降低，海马CA1区的LTP和突触传递受损，小鼠学习记忆能力下降。CaMKIIβ-ERK1/2-CREB/NF-κB信号通路参与了慢性氯胺酮引起的这些损害。

2. CaMKIIβ的上调可以逆转氯胺酮引起的GluA1、GluA2、GluN2A和GluN2B亚单位表达的减少、树突棘密度的降低、突触传递和LTP损害、认知功能损害。

本研究中所用到的CaMKIIβ过表达慢病毒LV-CaMKIIβ-Cherry（CV186载体：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-Cherry-IRES-puromycin）和对照病毒由吉凯基因提供。脑立体定位注射LV-CaMKIIβ-Cherry至小鼠海马区，成功实现了CaMKIIβ蛋白的过表达。

广州医科大学附属脑科医院范妮教授为独立通讯作者，广州医科大学附属脑科医院罗雅艳博士、余洋博士和张敏玲为本文共同第一作者 。该研究由国家自然科学基金面上项目、广东省自然科学基金项目资助。

范妮教授

医学博士，副主任医师，研究员，教授，博士研究生导师，广州医科大学附属脑科医院物质依赖科副主任，精神神经科学研究所副所长，中国药物滥用防治协会合成毒品研究分会委员会副主任委员，中国药物滥用防治协会常务理事，中国药物滥用防治协会成瘾医学分会委员会常务委员，中华医学会精神医学分会物质依赖医学组副组长，中华医学会精神病学分会物质依赖学组委员，美国精神科学会会员，美国神经科学学会会员，《四川精神卫生》、《精神医学新视点》、《中华精神科杂志编委》杂志编委。广东省杰出青年医学人才，广东省最美禁毒人，广州市医学重点人才，广医高水平大学学术骨干培育计划人才，羊城好医生。主要研究方向大脑海马区域离子通道型谷氨酸能受体和突触传递、炎症反应在神经精神疾病发病机制中的作用，及新型毒品氯胺酮所致精神障碍和认知损害的临床特征、生物学标记物及神经营养因子等。主持多项国家、省部级、市级课题，包括国家自然科学基金2项，广东省自然科学基金2项，广州市科技计划项目1项等。近年发表第一作者和通讯作者SCI论文20余篇,包括在国际知名杂志Cell（IF:38.637）、 Brain（IF:11.337）、 Molecular Psychiatry（IF:12.834）分别发表高水平论文。