Circulation：南京医科大学附属第一医院揭示心肌再生新机制-CHK1-mTORC1/P70S6K通路

缺血性心脏病（Ischemic heart disease, IHD）是全球发病率最高的疾病之一，心肌梗死（Myocardial infarction, MI）是IHD最严重的表现形式。近年来研究发现新生鼠心脏具有强大的再生能力，心脏梗死损伤后通过心肌细胞再生使心脏完全恢复正常，而成年人心脏中心肌细胞也保持着极其微弱的再生能力。因此探索心肌细胞再生机制对于缺血性心脏病的治疗具有深远的意义。

2020年2月26日南京医科大学附属第一医院在《Circulation》（影响因子23.054）上在线发表了题为“Phosphoproteomic Analysis of Neonatal Regenerative Myocardium Revealed Important Roles of CHK1 via Activating mTORC1/P70S6K Pathway”的文章，揭示了心肌细胞再生的关键机制。

该研究中作者利用定量蛋白组学、磷酸化蛋白组学及激酶调控网络分析发现心肌再生的关键激酶CHK1，并在细胞和动物水平证明了过表达CHK1可通过激活mTORC1/P70S6K通路改善成年个体心脏的心肌细胞再生能力。揭示CHK1有望成为MI后心肌细胞修复治疗的潜在新靶点。

首先作者构建了新生小鼠心梗损伤诱导心肌再生模型，对出生1天的小鼠进行LAD结扎手术，检测表明手术建模成功，新生鼠心脏在术后1个月恢复正常水平（图1）。

图1. 新生鼠心梗损伤诱导心肌再生模型建立与检测

模型建立后，作者通过定量蛋白质组学对新生小鼠心梗损伤后再生心肌细胞及对照新生鼠心肌细胞样品分析（图2），发现91个蛋白存在表达差异，其中62个上调。进一步对样品进行定量磷酸化蛋白组学分析（图3），结果表明再生过程中蛋白表达与磷酸化修饰水平改变以上调为主，且磷酸化修饰水平上调的底物蛋白主要富集于mTORC1信号通路。

图2. 定量蛋白质组学分析

图3. 定量磷酸化蛋白质组学分析

此外通过数据分析，预测出了11个蛋白激酶在心肌再生过程中活性明显增高（图4），并利用WB验证发现CHK1激酶在新生小鼠心肌再生时间窗内高表达，提示其在再生中扮演重要角色。

图4. 心肌再生相关蛋白激酶分析验证

接着，作者对CHK1激酶展开了进一步研究。体外模型中，作者使用吉凯基因腺病毒产品（Ad5-CHK1、Ad5-CON、Ad5-CHK1i、Ad5-CONi）感染在原代培养的乳小鼠心肌细胞中过表达或敲低CHK1，给予体外心梗模型处理后检测细胞增殖情况，结果表明CHK1激酶促进原代乳小鼠心肌细胞增殖。在体模型中，作者利用吉凯基因的AAV产品（AAV9-cTNT-CHK1、AAV9-cTNT-CHK1i、AAV9-CON）在新生鼠中过表达CHK1后新生小鼠心肌再生时间窗延长，利用吉凯基因腺病毒产品敲低新生鼠CHK1表达后新生小鼠心肌细胞再生能力受损，利用吉凯基因AAV产品在成年小鼠心脏中过表达CHK1后心肌细胞损伤后再生修复能力增强。以上结果表明CHK1是新生鼠心肌损伤再生修复的关键激酶。

图5. CHK1促进体外新生鼠心肌细胞增殖

作用清楚了，那机制是什么呢？

已报道的研究表明CHK1参与细胞周期进程与修复的通路主要有DNA损伤修复经典通路、磷酸化组蛋白H3通路、磷酸化E2Fs通路，然而在乳鼠原代心肌细胞过表达CHK1后并未检测到以上通路的变化，这就提示CHK1通过一种新的通路在心肌细胞再生中发挥作用。这时作者想到了磷酸化蛋白质组学分析结果中提示心肌再生过程中mTORC1通路被高度富集，于是进一步探究CHK1与mTORC1通路的关系。在成年小鼠心脏过表达CHK1后给予心梗损伤处理，结果发现过表达CHK1小鼠mTORC1/P70S6K信号通路激活增加且增殖相关基因翻译水平增加（图6），表明CHK1过表达可通过激活mTORC1/P70S6K通路促进成年小鼠心梗后心肌再生，改善梗死后心功能。

图6. CHK1 通过mTOR/P70S6K促进细胞增殖相关蛋白的翻译上调

1. CHK1激酶是新生小鼠心肌损伤后再生修复的关键激酶；

2. CHK1激酶过表达可通过激活mTORC1/P70S6K通路促进成年小鼠心梗后心肌再生，改善更死后心功能。

图7. CHK1的生理表达及外源性CHK1激活对心脏再生的调节作用模式图

该研究中腺病毒产品（Ad5-CHK1、Ad5-CON、Ad5-CHK1i、Ad5-CONi）、腺相关病毒产品（AAV9-cTNT-CHK1、AAV9-cTNT-CHK1i、AAV9-CON）、质粒产品（Raptor shRNA）均由吉凯基因提供。在在体及离体水平均实现高效特异的基因表达调控（图8）。

图8. 病毒感染后效果检测

南京大学附属第一医院心内科王连生教授、生殖医学国家重点实验室郭雪江教授为本文共同通讯作者，本文第一作者为范燚博士。

范燚 ，南京医科大学心血管内科学博士，现为东南大学附属中大医院心内科住院医师。以第一作者在Circulation、J Cell Biochem、Genetica等期刊发表多篇文章，曾获美国心脏协会（AHA）心血管研究新星奖，入选江苏省人民医院2018年十大“国际时刻”事件。

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