《Autophagy》：PD治疗新策略——分子伴侣介导自噬抑制突触核蛋白低聚物聚集

帕金森病（Parkinson disease, PD）是一种进行性神经系统疾病，主要症状包括震颤和运动迟缓。帕金森病患者需要终身治疗，药物治疗是目前最主要的方法。PD的主要病理改变是α-突触核蛋白（SNCA）的异常聚集导致大脑黑质致密区多巴胺能神经元的缺失，其病理过程受到衰老、易感基因以及环境因素的综合影响。那么研究如何防止突触核蛋白的聚集则为治疗PD提供了新的理论依据。”

2019年4月，国际权威刊物《Autophagy》（影响因子11.1）刊登了香港玛丽医院何树良（Shu-Leong Ho）教授课题组的研究成果“Age-dependent accumulation of oligomeric SNCA/α-synuclein from impaired degradation in mutant LRRK2 knockin mouse model of Parkinson disease: role for therapeutic activation of chaperone-mediated autophagy (CMA)”，该研究发现LRRK2基因突变通过干扰分子伴侣介导的自噬过程影响了伴随年龄增长引起的SNCA低聚物的降解，这一研究成果证实了分子伴侣介导的自噬能够抑制SNCA低聚物在脑内的聚集，为延缓PD进程提供了新的治疗策略。

LRRK2基因突变是家族性和散发性PD最常见的原因，研究者构建了LRRK^R1441G转基因小鼠，利用Dot-blotting和ELISA的方法来观察LRRK2突变是否会影响衰老的大脑中SNCA的聚集，发现与相同年龄的野生型小鼠相比，LRRK^R1441G转基因小鼠纹状体和皮层脑区呈现出明显的随年龄增长而出现的SNCA低聚物聚集（图1）。

图1. LRRK2^R1441G突变基因敲入引起小鼠纹状体和皮层随年龄增长的SNCA低聚物聚集

同样免疫组化的结果也显示SNCA低聚物的表达增加（图2）。

图2. 老年野生型和LRRK^R1441G转基因小鼠纹状体SNCA低聚物的免疫染色示意图

接着研究者通过免疫荧光染色观察LRRK^R1441G基因突变对细胞内溶酶体形态的影响，发现老年LRRK^R1441G转基因小鼠纹状体，溶酶体膜蛋白LAMP1和LAMP2A的表达增加，溶酶体在细胞核周围聚集明显增加，证实老年LRRK^R1441G转基因小鼠存在溶酶体缺陷（图3）。

图3. LRRK^R1441G突变基因引起核周围溶酶体聚集

分子伴侣介导的自噬（CMA）中，底物蛋白通过溶酶体膜上的受体进入溶酶体。蛋白水平检测、流式细胞术荧光检测以及免疫荧光染色结果显示，老年LRRK^R1441G转基因小鼠无论是纹状体还是腹侧中脑，与CMA相关的溶酶体膜蛋白LAMP2A、热休克蛋白HSP8A以及GAPDH（CMA的主要底物之一）的表达水平均上调（图4），提示LRRK^R1441G基因突变会导致CMA介导的溶酶体降解能力受损。

图4. 老年LRRK^R1441G转基因小鼠纹状体以及腹侧中脑CMA相关LAMP2A和HSP -8A蛋白水平上调

先前的研究发现CMA能够使内源性的SNCA降解。研究者在从野生型以及LRRK^R1441G转基因小鼠胚胎中分离胚胎成纤维细胞，过表达光控的全长SNCA慢病毒——PAmCherry-SNCA-NE以及其PAmCherry-KFERQ-NE（含KFERQ序列），观察CMA对SNCA清除的影响，发现LRRK^R1441G突变的胚胎成纤维细胞（MEFs）分解SNCA低聚物以及“KFERQ”底物多肽速率较野生型明显减慢（图5a&b），同时研究者使用吉凯基因提供的“KFERQ”突变型五肽-“KFSDA”过表达慢病毒作为对照，证实了非CMA底物的清除效率在MEFs和野生型细胞中没有差别（图5c）。

图5. LRRK^R1441G突变的胚胎成纤维细胞分解SNCA以及“KFERQ”底物多肽速率减慢

为了进一步确证LRRK基因突变的细胞的底物低清除效率是由于CMA过程受损，研究者利用siRNA敲低野生型细胞中的CMA相关溶酶体膜蛋白LAMP2A，发现能够显著降低KFERQ底物的清除效率（图6b）以及溶酶体活性(图6d)，而敲低MEFs中的LAMP2A则无影响。

图6. LRRK^R1441G突变的胚胎成纤维细胞中未发现LAMP2A特异的CMA蛋白降解过程

同时研究者也应用溶酶体抑制剂BafilomycinA1以及CQ进行干预，证实了MEFs中LAMP2A介导的溶酶体蛋白降解障碍（图7）。

图7. LRRK^R1441G突变的胚胎成纤维细胞溶酶体降解KFERQ样底物障碍

那么在成熟的初级皮层神经元中激活CMA过程又是否能够改变SNCA低聚物的聚集呢？研究者发现CMA特异性激动剂AR7能够显著降低LRRK^R1441G基因突变传代细胞（DIV21）中胞内和胞外SNCA低聚物的表达水平，进一步证实了SNCA低聚物聚集现象能够被CMA过程所抑制（图8）。

图8. AR7能够显著降低LRRK^R1441G基因突变传代细胞胞内和胞外SNCA低聚物的表达水平

1. LRRK^R1441G转基因小鼠纹状体和皮层脑区随年龄增长出现的SNCA低聚物聚集以及溶酶体障碍；

2. LRRK^R1441G基因突变导致CMA介导的溶酶体降解能力受损；

3. LRRK^R1441G基因突变通过干扰CMA过程抑制SNCA低聚物的清除。

该研究中CMA识别模体——KFERQ五肽序列突变质粒PamCherry-KFSDA-NE由吉凯基因构建并完成慢病毒包装。通过感染野生型以及LRRK^R1441G转基因小鼠胚胎成纤维细胞，来观察非CMA底物清除效率的变化，证明了SNCA降解是CMA过程介导的。

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