2021-01-31 02:40:05, 小融 融智生物科技(青岛)有限公司
SNP分型试剂盒-A
SNP分型试剂盒-B
PCR 扩增引物
质量探针延伸(MPE)引物
超纯水
离心管(EP管)2.0mL
QuanSNP核酸质谱系统
(1)使用商品化DNA提取试剂盒,按试剂盒中提供的操作说明书提取样本DNA。样品来源包括血样、组织、细胞、唾液等。
(2)使用超微量紫外分光光度计进行OD值检测,其中 OD260/OD280=1.8~2.0,表示DNA较纯;1.25%琼脂糖凝胶电泳检测,单一条带,无明显拖尾降解,表明 DNA完整性较好,质检合格。提取核酸分装后于-20℃储存备用。
根据 260nm 处的吸光值,1OD等于 50ng/μL的dsDNA的计算公式,计算提取核酸的浓度。DNA储存浓度要求50ng/μL最为适宜,实际使用时稀释为5-10ng/μL浓度再进行 PCR扩增反应。
注意:
(1)已提取的DNA须冷冻储藏,使用前解冻,涡旋混匀,但反复冻融不宜超过3次。
(2)待提取DNA的样本可能具有潜在感染力,操作前必须做好防护措施。
2.1 PCR Primer配制
参照 DNA合成报告对应项或管上标签提示,加入适量的缓冲液(TE)或水,稀释单管 PCR 引物至浓度100μM。混合所有单管PCR引物,超纯水补水定容至 PCR引物混合液中每条引物浓度为0.5μM。
如补水体积 V(μL)=混合引物总体积200μL-每条引物1μL×反应重数×2
2.2 MPE Primer配制
(1)参照 DNA合成报告对应项或管上标签提示,加入适量的缓冲液(TE)或水,稀释单管MPE引物至浓度200μM。根据具体引物不同的分子量,按照MPE引物配制表格进行MPE Primer的混合。
(2)MPE Primer在使用前需先上机点靶测试,保证MPE Primer全部出峰, 且低峰高度不低于高峰一半。若达不到此要求需在引物配制时进行微调,如低强度的引物可加大浓度。
注意:
(1)PCR Primer和MPE Primer需存放-20℃,使用时解冻,涡旋混匀,但反 复冻融不宜超过3次。
3.1 PCR反应流程
(1)用户可根据具体实验用量配制 PCR混合液。如果样品个数较多,除 DNA模板外的试剂可以预先混合成PCR mix,考虑到到枪头损耗,PCR mix一般多配10%左右。PCR mix如暂时不用,可放于4℃冰箱,最好不超过8h。
(2)在每个PCR反应管中分装PCR mix 4μL,加入已提取好的DNA模板1μL(共10ng)。轻轻涡旋混匀,1000rpm离心1min。
(3)混匀后按说明书推荐程序进行PCR反应。PCR温控程序见下。
(4)待PCR反应流程结束后,取出样品。待样品管冷却至室温,可进行下步实验。
注意 :
(1)PCR mix最好现配现用 。
(2)如有需要可将样品管离心后进行下步实验。
3.2 SAP反应流程
(1) 用户可根据具体实验量配制SAP mix。如果样品个数较多可以预先混合成SAP mix,考虑到枪头损耗,SAP mix一般多配10%左右。如暂时不用,可放于4℃冰箱,最好不超过8h。
(2) 在每个PCR反应产物管中加SAP mix 2μL,轻轻涡旋混匀,1000rpm离心 1min。按说明书推荐程序进行SAP反应。SAP温控程序见下。
(3) 待 SAP反应结束后,取出样品。待样品管冷却至室温,可进行下步实验。
注意:
(1)SAP mix最好现配现用。
(2)如有需要可将样品管离心后进行下步实验。
3.3 MPE反应流程
(1) 用户可根据具体实验量配制 MPE mix。如果样品个数较多,可以预先混合成MPE mix,考虑到枪头损耗,MPE mix一般多配10%左右。MPE mix如暂时不用,可放于4℃冰箱,最好不超过 8h。
(2) 在每个SAP反应产物管中加 MPE mix 4μL,轻轻涡旋混匀,1000rpm离心 1min。按说明书推荐程序进行MPE反应。MPE温控程序见下。
注意:MPE mix最好现配现用。
3.4树脂纯化
(1)在每个反应孔中加入 14μL 超纯水。
(2)把装有树脂的八连管轻轻翻转过来扣在样品板上,保证树脂孔与样品的每个孔对齐。然后轻敲树脂管,使树脂落入样本板的孔中。
(3)使用掌式离心机,瞬时离心,避免树脂附着在管壁上。
(4)将带有树脂的样品板放置在翻转混匀仪中,20 rpm混匀 30 min。
(5)混匀结束后,样品 2000 rpm 离心 1 min,上清液待测 。
3.5点样
取出OligoPlate靶板,滴加 0.5~1μL纯化后上清液,自然干燥结晶,待上机(QuanSNP核酸质谱系统)测定。
注意:制备好的靶板须在24 h内进行测试。
上机检测与数据分析操作步骤省略。
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