停，小心不合格蜂蜜毁了你的健康！

蜂蜜是众所周知的健康食品、日常养生佳品，内含多种维生素、矿物质和氨基酸，平价却具有多种保健功能。在购买时，我们除了要注意辨别蜂蜜的真假外，还要谨防蜂蜜中抗生素超标。

蜂蜜中检出抗生素？

蜜蜂在人工饲养过程中极易染病，虽然我国大力提倡生物防治，但在利益的驱使下，很多蜂场仍使用抗生素来对其进行治疗及控制，这就导致蜂蜜中会残留抗生素。在这些违规使用的抗生素中，氨基糖苷类抗生素最为常见。

氨基糖苷类抗生素是一种广泛应用于动物养殖的抗生素，对多种革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌有抗菌效果，是我国畜牧业、农业和水产业常用的兽药之一，也常被添加到饲料中促进动物生长发育。然而，该类抗生素可能选择性地损伤人类第 8 对脑神经，导致前庭和耳蜗神经损伤，且会导致肾近区小管损伤，出现血尿、蛋白尿、肾功能减退等症状。

建立蜂产品中氨基糖苷类药物的分析检测方法对保证蜂产品的质量安全具有重要保障和监测意义。今天给大家介绍一个使用固相萃取结合 LC-MS/MS 同时分析蜂蜜和蜂王浆中残留的8种氨基糖苷类抗生素的方法。

蜂蜜和蜂王浆中氨基糖苷类抗生素分析方法

本文在现有方法的基础上，建立了固相萃取结合液相色谱-串联质谱测定蜂蜜及蜂王浆中 8 种氨基糖苷类抗生素残留的分析方法。并对比评价了 Agilent Bond Elut Plexa PCX 和新品 Agilent Bond Elut Nexus WCX 固相萃取小柱对 8 种不同氨基糖苷类抗生素的吸附和保留情况，发现大多数氨基糖苷类抗生素在两种 SPE 柱中均具有很好的保留和洗脱性能，仅有链霉素和双氢链霉素在 PCX 柱上保留太强较难洗脱，而壮观霉素、潮霉素和卡那霉素在 WCX 柱上回收率较差。综合考虑，本文所述方法采用两种 SPE 柱配合使用，来完成对 8 种氨基糖苷类抗生素的分析，以确保检测数据的准确性。

1. 仪器与试剂

仪器：Agilent 1290 Infinity 高效液相色谱系统， Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统。

试剂：甲酸、乙腈均为色谱纯。

标准品：链霉素、双氢链霉素、新霉素、壮观霉素、庆大霉素、潮霉素B、安普霉素、卡那霉素，纯度≥99.0%。

前处理：Agilent Bond Elut Nexus WCX（新品）和 Bond Elut Plexa PCX 固相萃取小柱。

图 1. Agilent Bond Elut 系列固相萃取小柱

2. 样品前处理

蜂蜜样品前处理：称取蜂蜜 5g ，加入 10mL 磷酸盐缓冲液，涡旋混匀，超声 3min ，离心 10min ，将上清液转移至另一离心管中，再用 5mL 缓冲液重复提取一次，合并上清液并定容至 20mL ，混匀备用。取一半备用液直接过 Plexa PCX 柱净化，另一半备用液用 5mol/L 的氢氧化钠溶液调节 pH=7.5 0.1 过 Nexus WCX 柱净化。

蜂王浆样品前处理：称取蜂王浆样品 2g ，加入 5mL 水和 0.25mg 胰蛋白酶（ Sigma ），涡旋混匀 40 水浴震荡 2 小时，加入 10mL 磷酸盐缓冲提取液涡旋提取 1 分钟，离心 10min ，将上清液转移至另一离心管中，用 5mL 磷酸盐缓冲液重复提取一次，合并上清液并定容至 20mL ，混匀备用。取一半备用液直接过 Plexa PCX 柱净化，另一半备用液用 5mol/L 的氢氧化钠溶液调节合适的 pH 值过 Nexus WCX 柱净化。

固相萃取流程如图 2 所示 。

图 2. 固相萃取操作流程

3. 结果与讨论

色谱分离条件

方法采用安捷伦 Poroshell EC-C8 色谱柱，流动相中不添加七氟丁酸酐，仅在仪器检测进样样品中加入 1%（体积比）的七氟丁酸酐溶液，即可保证所有8种氨基糖苷类药物都具有很好的峰型和保留，见图3。用氯霉素评价此微量七氟丁酸酐试剂对仪器的污染状况，发现该实验条件不会对仪器造成任何污染，不影响负离子模式的检测结果。

图 3. 25 ng/ml 8 种氨基糖苷类抗生素标准品的 MRM 谱图

线性范围与检测限

8 种氨基糖苷类抗生素在浓度 10 ng/ml - 1 ug/ml 范围内线性相关，且线性相关系数均大于 0.99。在信噪比大于 1 和大于 3 时，测得 8 种氨基糖苷类抗生素在蜂蜜和蜂王浆中的检测限分别为 5 - 10 µg/Kg 和 5 - 12.5 µg/Kg，定量限为 15 - 30 µg/Kg 和 15 - 35 µg/Kg，远低于各个国家对于食品中氨基糖苷类抗生素 MRLs 的要求。

4. 结论

本文建立了固相萃取结合液相色谱-串联质谱测定蜂蜜及蜂王浆中 8 种氨基糖苷类抗生素残留的分析方法。方法灵敏度满足国际和国内标准对于食品中氨基糖苷类抗生素最大残留限量的要求，方法中流动相无需加入七氟丁酸酐离子对试剂，大大减少了离子对试剂对仪器的污染，有效解决了业内关注的七氟丁酸酐污染仪器的大难题，适合常规实验室对氨基糖苷类化合物分析。

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