2020-11-07 04:57:38 布鲁克电子显微纳米分析仪器部
布鲁克文章推荐 第45期
Bruker Journal Club
布鲁克纳米表面仪器部 王鑫 博士
2020年,COVID-19病毒肆虐全球,在全球范围内导致了累计四千万人感染,夺去了一百万人的生命,造成了难以估量的经济损失。针对COVID-19相关病毒入侵机制、抗病毒药物研发的研究成为了全球焦点。比利时鲁汶大学的David Alsteens团队使用单分子力谱技术研究了COVID-19的S糖蛋白与细胞膜ACE2受体的结合动力学,并通过结合强度变化展示了几种ACE2衍生多肽在抗病毒药物开发的潜在应用。相关工作(Molecular interaction and inhibition of SARS-CoV-2 binding to the ACE2 receptor)于2020年5月21日公布在预印网站ResearchSquare上,并于2020年9月11日发表在Nature Communications上(doi.org/10.1038/s41467-020-18319-6)。
COVID-19病毒通过膜表面的刺突糖蛋白(spike glycoprotein, S糖蛋白)与宿主细胞膜表面的血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2受体)相互作用介导进入宿主细胞。S糖蛋白位于COVID-19病毒表面,为三聚体结构,具有两个亚基,S1亚基包含受体结合结构域(RBD)实现与宿主细胞的受体结合,S2亚基参与病毒与细胞膜的融合过程(图1b)。该研究利用原子力显微镜,使用基于力曲线的成像模式研究了COVID-19的S糖蛋白S1亚基在ACE2模型表面与活细胞膜上ACE2受体结合的生物物理特性(图1c)。并通过对病毒S糖蛋白的靶向ACE2衍生短肽结合情况的研究,发现这几种肽抑制剂的显著的结合抑制特性。
S1亚基与ACE2受体特异性结合动力学
作者首先使用单分子力谱技术研究了模式表面上ACE2受体与S1亚基的结合动力学。在力曲线中识别出S1亚基与ACE2受体结合的事件,再在这些事件中提取S1亚基与ACE2的解离力与解离发生时对应的力加载速率(loading rate, LR)。使用Bell-Evans模型对解离力-LR进行拟合,可以获得S1亚基-ACE2受体相互作用的动力学参数,即解离速率常数koff与反应坐标xU。根据这些动力学参数可以获取该相互作用的自由能能垒(图2a~f)。对S1亚基或单独RBD区域与ACE2受体相互作用的研究表明,两者具有十分相近的动力学参数,且与前人基于SPR方法测得的数据吻合。使用单分子力谱技术还可以估算配体与受体的结合速率(kon)(图2g、h)。解离速率与结合速率的评估与对照实验(图2c)的引入,均展示了这一结合的特异性。
S1亚基在活细胞上的结合动力学
在模式表面建立的S1亚基与ACE2结合动力学需要在活细胞表面进行进一步检验。作者选取了A549作为模型细胞。该细胞可以少量的表达ACE2受体,而ACE2过表达的A549细胞可以诱导病毒的入侵。因此使用常规A549细胞(对照)与转染了ACE2-eGFP的A549细胞作为病毒的感染模型。共荧光共聚焦成像表明过表达的ACE2受体均匀的以岛形分布在细胞膜表面(图3b)。通过荧光共聚焦成像的帮助,选取对照细胞与转染细胞交界处进行基于力曲线的AFM成像实验(图3c)。基于力曲线可以获取细胞的AFM形貌图与黏附力图(图3d、e),而黏附力图则对应着力曲线中的S1亚基与ACE2的结合事件(图3g)。统计显示,过表达ACE2的A549细胞有着更高的结合率(图3f)。为了更好的进行动态力谱分析(DFS),通过改变峰值力轻敲模式的振幅与频率,可以获得更广域的力加载速率(图3g)。基于细胞膜表面ACE2受体与S1亚基获取的相互作用力与力加载速率的关系,可以很好的符合模式表面获得的Bell-Evans模型参数,证实了模式表面获取数据的生理相关性(图3h)。
S1亚基在活细胞上的结合的多通路分析
前人的研究表明,人源的S糖蛋白S1亚基拥有唾液酸的结合位点,整合素受体也是诱导COVID-19入侵宿主细胞的通路。因此唾液酸与S1亚基结合或cRGD与整合素结合都可能干扰COVID-19入侵宿主细胞。实验表明,唾液酸的加入使得ACE2过表达A549细胞、对照组A549细胞与S1亚基的结合概率有了显著下降(图3f)。而cRGD的加入与对实验组、对照组的影响均不明显(图3f),这与整合素倾向于在细胞底部表达吻合,因此细胞顶部主要为S1糖蛋白与ACE2受体的结合事件。
ACE2衍生多肽抑制S1亚基与模式表面或活细胞表面ACE2受体结合
在测量S1亚基与模式表面的ACE2受体结合时,在环境中加入不同浓度的ACE2衍生多肽,通过竞争作用抑制结合。统计表明,浓度在1 μM时即可实现显著的抑制作用(图4)。在ACE2过表达A549细胞表面的结合抑制实验中,[22-57]ACE2衍生多肽表现出了良好的抑制性,结合概率下降了~70%(图5)。展示了衍生多肽在抗病毒抑制剂开发中的潜在性能。
该工作使用了Bruker的生物型原子力显微镜搭配荧光显微镜进行。Bruker独家的PeakForce QNM与Advanced QI成像功能均可以实现基于力曲线的AFM成像,并进行单分子力谱实验的测量。
本文相关链接:
论文链接:
https://www.nature.com/articles/s41467-020-18319-6
NanoWizard® 4 XP BioAFM简介:
https://china.jpk.com/products/atomic-force-microscopy/nanowizard-4-xp-bioafm
Bioscoope Resolve BioAFM简介:
https://www.bruker.com/products/surface-and-dimensional-analysis/atomic-force-microscopes/bioscope-resolve/overview.html
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