探索肠道菌群代谢物和非酒精性脂肪肝的共基因效应

2018-12-27 11:59:26, 麦特绘谱麦特绘谱生物科技(上海)有限公司

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近些年非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）患病率迅速增长。据统计，全球NAFLD患病率在25%左右，我国NAFLD患病率达到15%以上。NAFLD已然成为全球关注的公共健康问题。关于NAFLD双生子临床研究表明NAFLD存在遗传性。尽管全基因组关联研究（GWAS）发现NAFLD与PNPLA3和TM6SF2基因位点有关，但这些常见风险等位基因并不能很好的解释NAFLD中的所有变异。代谢组学为NAFLD等疾病的分子机制提供了全新的见解。双生子及家庭队列研究表明血清代谢物轮廓存在家族相似性。此外，肠道菌群的改变已被发现是NAFLD发展的重要促进因素。

因此基于：1）NAFLD具有遗传特性；2）NAFLD血清代谢物轮廓存在家族相似性；3）肠道菌群与NAFLD发展存在显著相关性，加州大学Rohit Loomba教授提出了“血清代谢物特别是肠道菌群相关代谢物与NAFLD脂肪变性、肝纤维化存在共基因效应”的科学假说，采用代谢组学及肠道菌群相关技术对双生子及家庭成员进行血清代谢物、肠道菌群检测分析，并用肝组织活检NAFLD患者作为验证集进行验证，技术路线图如下。相关成果分别发表在《Hepatology》和《Cell Metabolism》期刊上。

血清代谢物与脂肪变性及纤维化

采用GC-MS和LC-MS/MS对50对双生子（37对单合子，13对双合子）及56位其他家庭成员进行血清代谢物检测，共发现1181种血清代谢物。其中，411种是未知代谢物。770个被鉴定的代谢物中排除超过50%缺失值或者低丰度的物质（测试集排除57个，验证集排除69个），剩余代谢物中少于50%缺失值的采用二分之一最小值进行填补。如果双胞胎同时出现同一代谢物缺失，那么就直接剔除进行遗传性相关分析。NAFLD/ non-NAFLD 之间共筛选出153种显著差异性代谢物与脂肪变性相关，在Highest MRE/Lowest MRE（磁共振弹性成像）之间筛选出86种显著差异性代谢物与肝纤维化相关，均归属8大类代谢通路：氨基酸、多肽、能量代谢、脂质、碳水化合物、核苷酸、辅因子、维生素和外源性物质。

经过年龄、性别、种族矫正后，对这些代谢物进行遗传性分析，发现440种代谢物具有显著的遗传性（h2：0.28-0.91）。在这些代谢物中，寻找到170种血清代谢物与脂肪变性存在共同遗传效应，94种代谢物与肝纤维化存在共同遗传效应，两者共有血清代谢物达56种（Fig.1, 2）。

血清代谢物与肠道菌群

对样本群中57例患者粪便进行肠道菌群宏基因组检测分析，与早期NAFLD患者相比，晚期NAFLD患者粪便中有更多Proteobacteria和更少的Firmicutes。在种水平上，研究人员发现E. coli丰度存在差异。与血清代谢物结果进行关联分析，作者发现56种差异代谢物中6种代谢物与菌群存在相关性：3-对羟基苯基乳酸（3-(4-hydroxyphenyl)lactate），N-甲酰蛋氨酸（N-formylmethionine），苯乳酸（phenyllactate），甘露醇（mannitol），尿囊素（allantoine），N- 2-呋喃甲酰-甘氨酸（N-(2-furoyl)glycine）。

3-(4-hydroxyphenyl)lactate与肝脂肪变性及肝纤维化共遗传效应

该项研究再次收集156例非酒精性脂肪肝患者（经肝组织穿刺检查）的血清，对测试集中筛选的代谢物进行再次验证。56种代谢物中有6个代谢物得到验证，但只有3-对羟基苯基乳酸（3-(4-hydroxyphenyl)lactate）与肠道菌群有关。该物质水平在测试集、验证集中均与肝脂肪变性、肝纤维化程度保持一致的变化趋势。进行遗传性相关分析，该物质的遗传度为h2: 0.67, 95%CI: 0.434-0.814, p<0.001；且与肝脂肪变性及肝纤维化共遗传效应分别为RG : 0.57, 95%CI: 0.27-0.80, p<0.001；RG : 0.54 , 95%CI: 0.036-1, p=0.036。

采用KEGG数据库，作者发现3-(4-hydroxyphenyl)lactate由3个主要的微生物酶进行催化：羟基苯丙酮酸还原酶（HPPR），D-羟化酶和肉桂酰辅酶A（苯乳酸基辅酶A转移酶）。该酶涉及菌群21种，主要是变形菌门和厚壁菌门。3-(4-hydroxyphenyl)lactate），phenyllactate与厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门显著相关。其中，粪便拟杆菌、梭菌属、大肠杆菌、厚壁菌属的CAG110, CAG129和 CAG176以及Subdoligranulum sp已在先前的研究中被证实与NAFLD晚期纤维化相关。

从测试集中筛选出血清代谢产物与肝脂肪变性及肝纤维化的关联性；经年龄、性别及种族校正后，鉴定出6种菌群相关代谢产物与肝脂肪变性及肝纤维化具有显著共同基因效应；采用验证样本集验证3-(4-hydroxyphenyl)lactate与肝脂肪变性及肝纤维化显著相关。3-(4-hydroxyphenyl)lactate与厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门中的某些成员显著相关，而这些细菌已报道与晚期肝纤维化相关。该研究初步证实血清代谢物特别是肠道菌群相关代谢物与NAFLD脂肪变性、肝纤维化存在共基因效应的观点。

小结

从假说的提出到逐步验证得出研究结论，总结该研究的亮点有：

1）两个独立而互补的前瞻性队列（排除过度饮酒、病毒性肝炎等），分别采用MRI-PDFF技术、MRE技术评估患者肝脏脂肪变性、肝纤维化程度，以及验证集患者均进行肝组织活检，确保样本病理诊断的客观可靠性；

2）双生子研究是分析遗传和环境因素作用大小的有效方法之一。根据遗传度以及检测效能计算样本需求量为36-74对双生子，而本研究采用50对双生子以及56位其他成员进行相关检测分析，保证样本量的合理性；

3）同时采用GC-MS和LC-MS/MS两个平台，尽可能多的检测血清中的代谢物，结合宏基因测序，分析肠道菌群分布及其功能，并对肠道菌群及其代谢物进行关联分析。

这些结果初步表明，NAFLD纤维化易感性可能是由于一个共同的遗传基础3-(4-hydroxyphenyl)lactate途径及其与肠道菌群联合作用引起。考察肠道菌群代谢物的变化为肠道菌群与非酒精性脂肪肝之间的研究提供了新的研究视角。但该研究也存在一定局限性，如现有横断面研究设计仅捕捉到NAFLD即时性代谢组学特征，需要纵向研究进一步确定3-(4-hydroxyphenyl)lactate在NAFLD中的作用及区分肝脂肪变性及肝纤维化的可靠性；人类细胞仅产生L型乳酸而细菌则还可以产生两种构型，因此3-(4-hydroxyphenyl)lactate的构型需进一步验证；NAFLD患者肠道菌群多样性的降低对血清、粪便胆汁酸谱等代谢物均有影响，粪便中相关代谢物又会产生怎样的变化趋势；此外，仍需要更大样本量的进一步研究来确定肠道微生物群、3-(4-hydroxyphenyl) lactate和NAFLD之间关系的精确遗传机制。

引用文章：

Caussy C, Hsu C, Lo M T, et al. Novel link between gut-microbiome derived metabolite and shared gene-effects with hepatic steatosis and fibrosis in NAFLD.[J]. Hepatology, 2018.
Loomba R, Seguritan V, Li W, et al. Gut Microbiome-Based Metagenomic Signature for Non-invasive Detection of Advanced Fibrosis in Human Nonalcoholic Fatty Liver Disease[J]. Cell Metabolism, 2017, 25(5):1054.

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