Gut | 菌群代谢物‘以小见大’论非酒精性脂肪肝

肠道微生物组与宿主间有着很强的共生关系。虽然健康个体的肠道菌群种类、相对丰度和组成相似，但个体的微生物特征仍存在差异性。一些亚洲国家如韩国和日本人群的拟杆菌（Bacteroidetes）分别为30.2％和36.6％，比美国人群（18.2％）高。不同肠段肠道菌群呈现高度多样性，大肠中约有1011个微生物细胞，而小肠中有108个，粪便和直肠粘膜之间菌群组成也不同。菌群多样性可以通过饮食、运动、药物（抗生素）、胃肠道感染、手术及地域改变而改变。如高脂饮食可使小鼠瘤胃菌科（Ruminococcaceae）降低，理研菌科（Rikenellaceae）升高，而运动会对不同BMI人群的菌群（如Collinsella spp、Faecalibacterium spp、Lachnospira spp）产生不同影响。

肠道菌群以多种不同方式与宿主互作，肠道与机体其他器官（脑、肾、肝）之间存在诸多联系。肝脏具有特殊的血液供应--肝动脉和门静脉。肝脏中大约70％-75％的血液供应来自门静脉，而门静脉则由脾静脉和肠系膜上静脉汇合而成。单糖和氨基酸等营养物质被肠道细胞的特异转运蛋白吸收，通过门静脉到达肝脏，再被肝细胞吸收并代谢。如果肠道屏障被破坏，肝脏将是第一个受到来自肠道微生物产物、毒素和微生物（如细菌和真菌）影响的器官（图1）。

肠道屏障包括物理屏障、生化屏障和免疫系统屏障。物理屏障主要由粘液层，微生物和单层肠上皮细胞通过紧密连接蛋白连接构成。具有抗微生物特性的分子，例如胆汁酸和抗菌蛋白（包括α-防御素和β-防御素、C型凝集素、抗菌肽、溶菌酶和肠碱性磷酸酶）维持和介导生物化学屏障。分泌型免疫球蛋白A和含有多种免疫细胞（B细胞、T细胞、树突细胞、中性粒细胞）的淋巴滤泡是免疫系统屏障的组成部分。肠道屏障功能障碍导致微生物发生迁移，其分泌的代谢物和其他微生物产物会从肠腔进入血液和淋巴管中，使它们能够到达包括肝脏在内的其他组织和器官。大量研究表明，患有酒精性肝病或肝硬化的患者肠道通透性增加，这可能是疾病进展的重要因素。

非靶向代谢组学技术的进步（核磁共振、气质联用和液质联用）有助于鉴定NAFLD患者的差异代谢物，例如琥珀酸、苹果酸、α-酮戊二酸、谷氨酰胺、丝氨酸、延胡索酸、α-酮丁酸、谷氨酸和乳酸，也可以发现一些在无菌下不能产生的重要代谢物，如胆碱代谢物三甲胺（TMA），次级胆汁酸脱氧胆酸（DCA），石胆酸（LCA），及短链脂肪酸（SCFA）。下面将与菌群相关的各类代谢物进行整理总结。

1）胆碱及胆碱相关代谢物

胆碱被认为是一种必需营养物质，它可以影响肝脏脂质和胆固醇代谢等多种生理过程，以及通过脂质第二信使和胆汁酸的肠肝循环参与信号转导。TMA是肠道微生物群的胆碱代谢产物，可通过门静脉到达肝脏，被肝黄素单氧酶氧化形成TMAO。TMAO可通过不同的机制促进NAFLD的发展，比如TMAO在HFD小鼠中上调葡萄糖代谢并增加胰岛素抵抗，TMAO也可以通过增加血清炎性细胞因子CCL2的水平来促进胰岛素抵抗。TMAO还可通过减少胆固醇转化为胆汁酸来影响脂质代谢和胆固醇稳态。除此之外，TMAO促进动脉粥样硬化，增加心血管疾病风险以及2型糖尿病相关疾病，而这些疾病也与NAFLD存在关联，表明TMAO可能间接影响NAFLD。临床前及临床证据表明，肠道胆碱代谢生成的TMA和TMAO可导致脂肪肝疾病的发展（图2）。采用减少TMA和/或TMAO的策略可用于治疗或预防NAFLD。例如，胆碱的结构类似物3,3-二甲基-1-丁醇，通过抑制微生物TMA裂解酶从而抑制TMA产生，降低TMAO水平，降低高胆碱或左旋肉碱饮食小鼠的动脉粥样硬化风险。基于个体不同的微生物特征，3,3-二甲基-1-丁醇可能仅对一部分脂肪肝患者有效。因此，需要对NAFLD患者队列进行额外的分型，以确定NAFLD全部还是部分患者具有系统性TMAO升高的表型。

2）胆汁酸

胆汁酸及其代谢物有助于维持肝脏葡萄糖、胆固醇和甘油三酯的代谢稳态。临床前研究表明胆汁酸可通过改变核胆汁酸受体法尼醇X受体（FXR）信号传导促进NAFL和NASH的发展。初级胆汁酸鹅去氧胆酸（CDCA）激活FXR信号，而次级胆汁酸DCA抑制该信号并抵消CDCA的作用。FXR通过不同机制调节葡萄糖和脂质代谢，例如增加胰岛素敏感性，抑制肝脏糖异生基因和增加肝糖原合成。FXR还可以诱导肝成纤维细胞生长因子21（FGF21）的表达和分泌，刺激脂肪组织中葡萄糖摄取代谢。FXR活化还将抑制脂质生成、促进脂肪酸氧化同时影响胆固醇转运。此外，FXR可诱导小鼠回肠中FGF15（人类-FGF19）的表达，该蛋白与肝细胞上的FGF受体4（FGFR4）和klothoβ（KLB）结合，抑制CYP7A1表达和胆汁酸合成。胆汁酸也可以与G蛋白偶联受体TGR5结合。胆汁酸可抑制脂多糖（LPS）诱导的细胞因子如白细胞介素1α（IL1A）、IL1B、IL6的产生，以及通过TGR5-cAMP依赖性途径抑制Kupffer细胞产生的肿瘤坏死因子（TNF）。TGR5具有调节肝脏炎症作用，通过诱导胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的表达和抑制NLRP3炎性体的激活来调节葡萄糖稳态。给小鼠补充TGR5或FXR激动剂可抑制脂质生成，改善高胆固醇血症，诱导能量消耗和减少肝脏炎症来降低NAFLD发生。

临床研究表明，胆汁酸稳态及其相关信号通路的失调与NAFLD的发生有关。与健康受试者相比，NASH患者的血清和尿液样品中胆汁酸如CDCA，DCA和UDCA浓度增加，肝组织中胆酸水平增加。有趣的是，另一个研究小组发现，NASH患者肝脏CA和DCA的水平显著下降。此外，与NAFL患者相比，NASH患者血浆甘氨胆酸盐，牛磺胆酸盐，甘氨酸脱氧胆酸盐，牛磺酸脱氧胆酸盐和熊去氧胆酸水平增加。而牛磺石胆酸，甘氨胆酸盐、牛磺胆酸盐的水平分别与门静脉炎症、小叶炎症、脂肪变性和肝细胞气球样病变严重程度相关。目前用于治疗NAFLD的FXR或TGR5信号传导激活的药物正在开发中。与安慰剂相比，FXR激动剂6-乙基鹅脱氧胆酸（奥贝胆酸）可降低患者肝脏样本中NASH的组织学特征。 此外，名为NGM282的FGF19类似物可迅速降低NASH患者的肝脏绝对脂肪含量。胆汁酸代谢变化通过FXR和TGR5信号传导影响NAFL和NASH的发展（图3），临床试验中阳性结果表明微生物群介导的胆汁酸变化可作为新的治疗靶点。

3）短链脂肪酸

短链脂肪酸（SCFAs）不仅是肠上皮细胞重要的营养和能量来源，还提供脂质生成和糖异生（从非碳水化合物底物如乳酸、甘油和生糖氨基酸产生葡萄糖的代谢途径）的前体。临床前研究表明，SCFAs激活G蛋白偶联受体（GPCRs）GPR41和GPR43，它们在脂肪细胞和肠内分泌L细胞上表达。GPCRs激活促进肥胖和代谢疾病发生，并且可通过多种机制参与脂肪肝疾病发生发展。GPR41和GPR43激活刺激YY肽的分泌，抑制肠道蠕动，减缓肠道运输，从而加强营养吸收，提高饮食中能量的获取并促进肝脏脂肪生成。此外，GPR41和GPR43激活促进GLP-1分泌，不仅抑制胃排空和食物摄入，还激活肝细胞基因调节脂肪酸β-氧化和胰岛素敏感性。脂肪细胞中GPR43的激活抑制脂肪分解并降低血浆脂肪酸。SCFAs除了激活GPR41和GPR43外，还可通过门静脉入肝促进脂质和葡萄糖代谢。乙酸盐是脂肪酸合成的重要基质，肝脏中乙酸盐增加会导致甘油三酯积累，丙酸盐是糖异生前体物质，其水平升高则促进肝脏糖异生，而甘油三酯的积累和糖异生都与NAFLD的发展有关。虽然SCFAs可直接或与GPRs结合促进NAFLD，但SCFAs的其他作用也可能有益于NAFLD发展。例如，丁酸可激活AMP激活蛋白激酶（AMPK）来调节NAFL和NASH的发展。AMPK抑制氧化应激和炎症，通过影响葡萄糖和脂质代谢调节能量稳态，通过调节线粒体功能来控制脂肪酸氧化，通过降低甾醇调节元件结合转录因子1c（SREBP-1c）活性来抑制脂肪生成基因的表达。

SCFAs对NAFL和NASH的发展既有促进作用又有抑制作用，这取决于它们激活的信号途径或机制，包括GPR41和GPR43、AMPK、HDAC抑制和/或直接促进肝脏甘油三酯积累和糖异生（图4）。采用三丁酸甘油酯（一种丁酸盐药物前体）治疗野生型小鼠可预防饮食诱导的肥胖、肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗。补充乙酸盐或丙酸盐减少肝脏脂肪酸的摄取和抑制肝脏内脂肪生成可以预防饮食诱导的体重增加、胰岛素抵抗和肝脏脂肪变性。临床研究表明，纤维化晚期患者粪便样品富含甲酸盐和乙酸盐，而轻度或中度NAFLD成人粪便样品则富含丁酸盐和丙酸盐。因此，SCFAs水平变化可能与脂肪肝疾病严重程度相关。肠道微生物群代谢物SCFAs的改变是否会导致影响NAFL或NASH患者的病情值得进一步研究。

4）乙醇

临床研究表明，摄入无酒精食物后，受试者血液样本中可检测到低水平内源性乙醇，说明内源性乙醇可能是由肠道微生物产生。酒精性脂肪性肝炎和NASH具有相似的组织学特征，通过肠道微生物群产生乙醇会增加NAFL或NASH患者肝病严重程度。临床前研究已经确定乙醇可增加肠渗透性，例如肠炎性细胞因子表达增加。乙醇代谢产物乙醛也会影响紧密连接蛋白的功能。不过还需要进一步研究来探讨肠道通透性增加的NAFLD患者是否通过微生物群代谢导致乙醇产量增加。内源性乙醇抑制三羧酸循环，从而增加乙酸盐水平，促进肝细胞甘油三酯的积累。乙醇还可以增加CYP2E1的活性以催化乙醇氧化并产生可能促进肝脏炎症的自由基，此外，乙醛具有氧化剂依赖性代谢和细胞毒性作用，可进一步增强肝损伤。由此，内源性乙醇可能通过增加肠道通透性、乙酸盐水平和形成乙醛来促进肝脏损伤，从而诱导NAFLD发生。

NAFLD患者的粪便样品中一些醇、酮、酯、乳酸盐（L-乳酸盐和D-乳酸盐）水平都较高，血液（血浆和/或血清）样本中葡萄糖、一些脂质（单不饱和脂肪酸）和支链氨基酸（亮氨酸，缬氨酸和异亮氨酸）水平较高，尿样中具有较高水平的葡萄糖和支链氨基酸，患者肝脏中丁酰肉碱（C4）和月桂酰肉碱（C12）水平增加，而亚油酸水平降低。尽管这些代谢物在不同样本中变化多样，但琥珀酸、葡萄糖、支链氨基酸和一些非必需氨基酸（酪氨酸和半胱氨酸）在NAFLD患者的多种样本类型中均增加。这些一致的发现为开发NAFLD诊断生物标志物提供可能。琥珀酸盐在NAFLD患者粪便、血清和肝脏样本中均增加，它可能通过激活肝星状细胞GPR91产生α-平滑肌肌动蛋白（肝纤维化生物标志物）来促进NAFLD进展。琥珀酸是哺乳动物细胞和肠道微生物如类杆菌和普氏菌产生的重要代谢产物，而这些微生物在NASH患者粪便样本也升高。最近的一项研究表明血浆苯乙酸与肝脏脂肪变性、NAFLD活动度积分相关。苯乙酸是蚂蚁胸膜腺分泌物和人体内苯乙胺的氧化产物。肠道细菌也可以产生苯乙酸。苯乙酸通过诱导人原代肝细胞中的甘油三酯积累和促进脂质代谢基因（LPL和FASN）表达来促进NAFLD的发展。它可以减少AKT磷酸化导致胰岛素抵抗。NAFLD患者血清样本中3-（4-羟基苯基）乳酸的水平也升高，它由细菌酶如D-氢化酶、肉桂酰辅酶A(苯基乳酸辅酶A转移酶)合成，许多肠道微生物能够产生它。3-（4-羟基苯基）乳酸还具有与肝脏脂肪变性、纤维化共基因效应（往期软文《探索肠道菌群代谢物和非酒精性脂肪肝的共基因效应》）。琥珀酸、苯乙酸和3-（4-羟基苯基）乳酸是可促进NAFLD发展的肠道微生物代谢物，将可能开发为诊断性标志物。研究人员可采取减少微生物生产琥珀酸、苯乙酸和3-（4-羟基苯基）乳酸的方式缓解NAFLD的发生或发展。

小结

大量临床前研究表明，肠道微生物群改变可以促进脂肪肝的发展。虽然普遍认为迁移的肠道微生物产物会加速NAFLD进程，但只有不到一半的NAFLD患者出现肠道通透性增加的表型，这是基于少数患者进行肠道通透性检测和该检测技术壁垒造成，未来需要更多NAFLD患者来评估肠屏障功能障碍。 另一方面，其他微生物因子如菌群相关代谢物，对NAFLD疾病进展很重要。代谢组学研究具有一定挑战性，许多检测到的代谢物是未知的，且被报道是微生物来源的代谢物极少，其功能更值得深入研究。NAFLD患者代谢组学研究结果存在不一致甚至相互矛盾的结果，这可能是由于患者数量相对较少、缺乏统一的方法和标准化流程所致。一旦研究结果可以验证，这些差异可能会为NAFLD分型提供重要依据。此外，并非所有NAFLD患者的肠道屏障均受到破坏，因此不同的NAFLD亚型可能具有不同代谢物作为疾病进展的驱动因素。精心设计的代谢组学研究、更大规模的临床研究、不同种族背景及统一方法学，用来监测不同样本（粪便、血清/血浆、尿液和肝脏组织）中的代谢物随时间的变化规律（不仅报告某种代谢物平均值，还要报告正常、升高或降低的患者比例）将为脂肪肝和脂肪性肝炎发展机制、新的诊断和治疗方法提供全新的见解，并为个性化治疗方法开辟新的途径。总的来说，鉴定NAFLD相关微生物代谢产物尚处于起步阶段，通过技术的不断进步和设计更好的临床研究，能够将NAFLD患者分为不同的代谢亚型，并为个性化或亚型特异性治疗提供科学依据。

参考文献：

Chu H, Duan Y, Yang L, et al. Small metabolites, possible big changes: a microbiota-centered view of non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 31 August 2018. doi: 10.1136/gutjnl-2018-316307

 

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