​小分子药物非临床制剂杂质和降解产物的分析方法开发和验证

非临床研究制剂（也称为临床前或非GLP制剂）在药物的早期开发中起着关键作用。这种制剂能够把药物（原料药）带入到试验动物中进行药动学和毒理学研究。由于这些研究最终会用于支持人的剂量和安全性，因此对了解药物的浓度、PK/PD、工艺杂质和降解杂质的安全性数据是很重要的。因此，业内人士已开展对能够准确检测和定量药物活性成分、杂质、降解杂质的方法进行开发和验证。这种方法往往能够提供稳定性的趋势性结果，因此称为稳定性指示方法。

研究中使用的所有分析方法都应该是符合其使用目的，能够获得可靠结果并没有显著偏差的。这些非临床研究中的分析方法主要在于提供微量杂质和降解产物的定量结果。用于稳定性指示方法的开发与验证应基于此目的进行设计，保证具有足够的选择性、灵敏度。有几个重要的部分需要考虑：

（1）降解试验

在非临床研究中，如果有足够的时间和样品，在稳定性指示方法的开发中应考虑进行降解试验研究。通常，在这个阶段，药物的工艺杂质已经确定，强制降解研究可以为药物由于化学或者物理不稳定性结果提供一个多维度的分析。方法开发中的降解试验应对潜在的氧化、光照、水解杂质具有选择性。需要注意的是降解试验中产生的降解物在正常贮藏条件也可能或不可能产生。如果降解产物可能引起安全性或毒性问题，在临床前研究中应进行必要研究。

所有的降解试验可以使用活性成分预期浓度的储备液进行。实验应在活性成分的预期剂量浓度下用原液进行，可以采用确定处方进行配制，如果处方没有最终确定，可采用溶液进行。

考虑降解条件，储备液可以采用乙腈-水和甲醇-水作为溶剂配制，推荐配制质控样品。所有的降解产物的UV光谱应采用PDA检测器测定。如果没有PDA检测器，UV/Vis检测器应使用210-220nm的检测波长，但是此时，是无法获得峰纯度数据的。UV光谱应与活性成分进行比较，以确定杂质、降解产物的相对响应是否与主峰一致。例如如果方法的检测波长为235nm，降解产物在这个波长下没有吸收，那么这个杂质就不会获得质量平衡。任何降解试验应在短期或者不苛刻的条件下进行。

主要降解途径的敏感性可以通过观察活性成分的降解程度来获得。如果出现10%或更少，说明在临床前制剂中出现的可能性小，如果药物损失较大，说明在临床前制剂中出现潜在降解产物的可能性大，应该在方法验证中对降解产物进行分离度和定量考察。确定关键的降解途径有助于对临床前处方和贮藏条件进行确定。以下为几个常见的降解试验设计：

自由基氧化可以使用偶氮二异丁腈（Azobisisobutyronitrile，AIBN）来进行研究。取约10mg的AIBN，加入到盛有10ml储备液的20ml量瓶中，在40℃下反应1-3天。

亲核氧化反应可以通过在储备液中或处方中加入稀过氧化氢溶液，在室温下反应24h进行。可能产生N-氧化物或亚砜杂质。

酸水解可以通过在储备液中或处方中加入稀盐酸溶液进行。降解溶液可以在室温或60℃条件下放置3天。同理，碱水解可以通过稀氢氧化钠溶液以相同方式获得。二者可采用相应的酸碱稀溶液进行中和。

光降解试验可以采用乙腈/水或甲醇/水储备液或计划处方，在ICH规定光照箱中进行10w/m2的20h试验。

热降解试验可以采用储备液在高温下进行，典型条件是在60°C 进行24–48 h, 基于贮藏条件，其他室温以上的条件也可以采用。

质量平衡应进行考虑，有很多因素会导致质量不平衡，如：降解产物没有发射团、在死体积时洗脱下来、极性太大、或由于疏水性强，特别是如果形成了二聚体或加合物，而没有在梯度条件下被洗脱下来。

对于非临床分析，通常认为所有的杂质具有相同的响应因子，如果在检测波长下降解产物的响应因子与火活性成分差异较大（超过20%），可能就不会获得质量平衡。如果由于上述原因没有获得质量平衡，结果应进行记录，并在后续开发阶段进行进一步研究。

（2）降解试验的问题解答

与任何方法开发项目一样，实际发生的事情往往与计划不同。以下是一些处理问题的方法。

助溶剂：当采用乙腈作为助溶剂时，有可能形成甲酸。甲酸与仲胺在溶液中会形成加合物。在这种情况下，当进行水解研究时，可以考虑使用其他溶剂，如DMSO。

pH值：当使用极端pH值进行降解研究时，如果采用HPLC/UV检测或发现峰形较差时，要使注入HPLC的溶液的pH值与流动相的pH值接近。建议流动相或缓冲溶应具有更强的离子强度来控制溶液的pH值，以使峰形不受影响。强烈建议在HPLC之前检查样品溶液的pH值，一般pH值范围为2-8对大部分色谱柱是可以接受的，但是应关注厂家的推荐范围。

混悬液：对于悬浮液制剂样品，在进行任何分析前必须保证均匀性。通常包括将样品进行涡旋或强力混合，确保代表性。如果溶液不均一，将会导致杂质和降解产物含量测定结果不准确。

杂质水平：注入HPLC的API浓度应足够高，确保所有相关杂质/降解产物峰能够出峰并定量。杂质/降解产物峰没有彼此分开的，可以通过调整流动相组成、pH、柱温、柱长、梯度斜率进行调节。

色谱方法：梯度洗脱优于等度，应以高比例水相开始，以高有机相比例结束。注意不要使缓冲液在高比例有机相中出现浑浊。采用UV检测时，推荐使用尽可能低的波长确保杂质/降解产物峰能够被检测到。采用API的最大吸收波长可能不会检测到在这个波长下没有的降解产物峰。采用PDA检测器可以检测峰纯度和光谱图来增加专属性。推荐使用15cm或以上柱长、≥5µm粒径的色谱柱来增加HPLC分离度。对于UPLC，应使用短的、细粒径的色谱柱。色谱柱填料应确保对pH和高比例水溶液耐用。C18为常用的色谱柱填料，色谱分离的目标是通过使用恰当的固定相使杂质/降解产物峰分离，色谱柱的选择对于成功进行方法开发和验证至关重要。

需要注意的事情如下：

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方法验证推荐方法

方法验证的目的是通过定性和定量数据证明非临床制剂测试结果可靠和准确。稳定性指示方法的灵敏度和专属性对于测定微量杂质和降解产物来说非常重要。验证参数和可接受范围应基于使用目的来确定，需要一定的准确度和精密度。每一个参数和可接受范围在方法验证方案中进行设置。方法要能够区分活性成分、已知降解产物及处方中的其他组分或与API相关的成分（如残留起始原料、中间体、副产物、辅料等）并能够保证结果准确可靠。

方法被验证后，对方法的任何更改都将需要进行部分验证。部分验证通常包括对方法中任何参数的评估。此外，如果验证的方法被转移到另一个实验室，则要起草方法转移方案。 

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方法验证参数

（1）专属性/选择性

专属性/选择性是指方法区分API和其他成分的能力。其他成分包括辅料、容器的溶出物、残留溶剂、测试物相关的杂质或降解产物。专属性/选择性应通过那些潜在干扰成分与活性成分的干扰情况（如辅料、空白溶剂）以及降解试验进行评价。色谱法中，其他峰应与主峰分离，保证所积分的色谱峰的准确性和重复性。此外，对于降解样品，应采用PDA或MS对活性成分进行峰纯度评价，并与新配制的溶液进行比较，确保没有与主峰共洗脱出色谱峰。已知杂质或降解产物应加入到新配制的含活性成分的溶液中，确保与被测定峰完全分离。

（2）准确度

准确度表示测量结果与理论结果的接近程度。如可能，可把降解杂质以活性成分的不同水平加入到样品中。如果不能获得，降解样品可以用来测定方法的准确度。准确度采用待测物的回收率百分比、相对误差或者与理论值的偏差来表示。方法的准确度与方法的使用目的有关。

（3）精密度

精密度表示在相同仪器条件下待测成分每个测定结果的接近程度。低含量杂质的精密度应采用绝对差而不是%RSD或%CV表示，因为二者会受到低含量杂质的负面影响。精密度应采用至少三份（推荐5-6份）样品进行评价。

（4）线性与范围

方法的线性范围应包括在整个分析浓度范围。稳定性指示方法的检测能力很关键。分析物浓度与检测器响应值进行线性回归，当相关系数≥0.99时线性关系良好。因为在早期开发阶段单独分离的杂质单体可能没有获得，因此，每个杂质对主峰的相对响应因子（RRF）在非临床阶段被认为是1。在开发后期，这些值应通过实验进行测定。

（5）检测限与定量限

检测限（LOD）是分析物与空白样品背景响应比的最低分析浓度，通常为空白样品响应值的3-5倍。定量限（LOQ）是具有一定准确度与精密度的最低检测浓度。二者可通过不同方法进行测定。无论使用哪种方法，在记录中应进行清晰准确的记录所采用的方法。通常，所采用的方法基于分析物的可获得性。LOD有时不用测定，除非这个杂质或降解产物是感兴趣的成分或者其浓度低于LOQ，这种情况下获得LOD数据可以有助于评估分析物的浓度。

（6）耐用性

耐用性通过方法参数的微小改变进行评估。包括流速、流动相组成、pH、柱温、不同使用时间色谱柱、不同批号色谱柱、不同人员等。这些变化可以通过以下参数进行评估：拖尾因子、分离度、理论板数、准确度、精密度、LOD或LOQ。

（7）稳定性

样品在储存、制备和分析中的稳定性应进行评估。包括API的稳定性、制剂的稳定性、过程处方的稳定性、冻-融的稳定性、活性储备液的稳定性。每个溶液应该采用恰当的储藏条件（如室温、冰箱、冷冻等）考察一定时间来评估稳定性。降解产物的杂质定量分析方法考察每个杂质量

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