Nature Communications | 谷氨酰胺氮代谢转变有助于癌症恶性进展

本研究首先通过将hTERT、SV40早期区域和c-Myc (TSM)导入正常人源二倍体成纤维细胞系TIG-3中建立转化细胞（TSM），将在三维（3-D）培养基中生长的TSM克隆在2-D培养基中扩增以获得AIG（锚定非依赖性生长）-1、AIG-2和AIG-3细胞，TSM到AIG-3的恶性进展与c-Myc表达增加有关（图1e-f）。

对TSM及AIG-1、AIG-2和AIG-3细胞进行iMPAQT分析，共检测到342种代谢酶。与TSM细胞相比，AIG-3细胞中某些糖酵解酶如己糖激酶2（HK2）、烯醇酶1（ENO1）和乳酸脱氢酶A（LDHA）的丰度增加，且葡萄糖摄取也增加（图2a），表明Warburg效应在AIG-3细胞中更为明显。GO富集分析显示，AIG-3细胞中受影响最大的生物学过程是核酸生物合成途径（图2b），核苷酸从头和回补途径涉及的大多数酶的数量（如PPAT）都是协同增加的，但谷氨酰胺回补通路限速酶GLS1被下调（图2c-d），而丙酮酸脱氢酶E1α亚基（PDHA1）（氧化丙酮酸从而导致TCA回补）则被上调（图2c-d）。为了验证蛋白质组水平观察到的葡萄糖代谢变化，本研究采用[¹³C₆]葡萄糖进行同位素分析（图2e），结果显示，与TSM细胞相比，AIG-3细胞柠檬酸、天冬氨酸、谷氨酸的¹³C标记效率和代谢物池大小显著增加（图2f–h），尤其是柠檬酸、天冬氨酸和谷氨酸的M+2增加与AIG-3细胞中PDHA1介导的丙酮酸的碳源增加是一致的。在癌症恶性进展过程中，依赖谷氨酰胺作为关键底物的核苷酸从头生物合成途径中的PPAT水平和进入TCA循环的谷氨酰胺回补途径中的GLS1水平在恶性进展中以相互作用方式进行调节。在AIG-3细胞中PPAT表达基因受c-Myc调控而表达上调（图1e），相反GLS1 mRNA表达下调。

为了证实蛋白质组水平观察到的谷氨酰胺代谢的变化，在TSM和AIG-3细胞中对[¹³C₅/¹⁵N₂]谷氨酰胺进行同位素分析(图3a)。TSM和AIG-S在2D培养物中的细胞生长（图3b）或[¹³C₅/¹⁵N₂]谷氨酰胺掺入以及¹⁵N和¹³C标记的谷氨酸和天冬氨酸产物（图3c e）都没有显著差异。稳态下的标记效率可以反映许多代谢反应的活性却很难评估对单个反应的影响，因此，作者评估了标记后早期（0.25h）和晚期（6h和24h）对每个反应的标记效率。在TSM或AIG-3细胞中均未检测到¹³C标记的IMP、AMP、GMP或UMP，而相比TSM细胞，在标记后6h和24h，AIG-3细胞核苷酸从头生物合成途径中¹⁵N标记的IMP（图3f）、AMP（图3g）、GMP（图3h）和UMP（图3i）显著增加。在AIG-3细胞中，IMP氮标记效率不仅在M+1和M+2组分中增加，而且在M+3中也增加（图3f），表明源于[¹⁵N]谷氨酰胺的[¹⁵N]天冬氨酸也有助于此标记（图3e）。与TSM细胞相比，AIG-3细胞中¹⁵N核苷酸（IMP、AMP、GMP和UMP）标记效率提高（图3f-i）与其池的减小有关。考虑到AIG-3细胞中核酸合成酶的显著上调和核苷酸标记效率的显著提高，这些细胞中核苷酸代谢物池的减小可能是由核苷酸合成速率的增加所致。

在含有人体血浆生理浓度氨基酸的培养基中培养5天后，用0.6 mM [¹³C₅/¹⁵N₂]谷氨酰胺标记TSM和AIG-3细胞，AIG-3细胞对AMP和GMP的¹⁵N标记效率显著高于TSM细胞。在标记后0.25h基本上未检测到¹⁵N核酸代谢物，这表明在早期由GLS1介导的谷氨酰胺回补反应主要负责α-KG和富马酸的产生。标记6h或24h后两种细胞中α-KG和富马酸盐的¹³C标记效率没有差异（图3j-k），表明在该时间点这些代谢物反映了源自GLS1和PPAT依赖途径的总和。与TSM细胞相比，AIG-3细胞在0.25h时α-KG和富马酸标记效率显著降低（图3j-k），表明AIG-3细胞中GLS1活性降低。综上，蛋白质组学和代谢组学数据一致表明，在实验癌细胞模型恶性转化过程中，谷氨酰胺的命运基本上从TCA循环转移到核苷酸从头生物合成途径。

在恶性转化过程中，PPAT表达的增加和GLS1表达的减少导致PPAT/GLS1比值增加。为了研究这两种酶之间的平衡是否对细胞增殖具有决定性作用，作者检测了AIG-3细胞中GLS1过表达的影响（图4a）。在[¹³C₅/¹⁵N₂]谷氨酰胺代谢组学分析中以酶促失活的GLS1突变体（S286A）作为对照，强制表达GLS1导致α-KG标记率增加，而IMP（图4b）、AMP、GMP、谷氨酸和天冬氨酸标记率降低。AIG-3细胞在2-D（图4c）或3-D（图4d）培养基中的增殖速率也由于GLS1过表达而显著降低。且用GLS1抑制剂CB-839处理可逆转GLS1过表达并抑制AIG-3细胞增殖（图4c）。总的来说，GLS1的过度活化会抑制肿瘤生长。

作者分析了短发夹RNA（shRNA）介导的RNA干扰对AIG-3细胞PPAT耗竭的影响（图4g）。PPAT的消耗显著抑制 [¹³C₅/¹⁵N₂]谷氨酰胺中¹⁵N标记的IMP、AMP和GMP（图4h），却增加了¹³C 标记的α-KG（图4h）。在对照和PPAT缺失的AIG-3细胞中谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸的标记效率、池大小和同位素分布无显著差异。PPAT的消耗也降低了AIG-3细胞在2-D（图4i）或3-D（图4j）培养基中增殖速率。此外，与对照细胞相比，PPAT缺失的细胞在裸鼠中形成的肿瘤更小（图4k）。由此表明PPAT活性降低会抑制肿瘤生长，GLS1和PPAT之间的平衡控制着谷氨酰胺衍生的碳和氮代谢从而调控细胞增殖和肿瘤生长。

PPAT和GLS1之间的平衡对人类癌细胞系增殖具有决定性作用。当GLS1或PPAT分别过表达时，A549和HeLa两种细胞体内外均可被抑制或促进，而A549和HeLa细胞中GLS1缺失则不影响其在2-D培养基中的增殖，也不影响裸鼠肿瘤形成，相反，两种细胞系中PPAT缺失抑制了其在2-D和3-D培养基中的增殖，并抑制裸鼠肿瘤的形成。不同类型肿瘤细胞对谷氨酰胺代谢的依赖性会有所不同，作者对118个来自不同人体组织的癌细胞系的包括GLS1和PPAT在内的代谢酶丰度进行检测分析，发现PPAT/GLS1比值在这些细胞类型之间均存在显著差异(图5a)。PPAT/GLS1比值高的细胞如BT-549乳腺癌细胞(图5b)，TGW神经母细胞瘤细胞(图5c)和U-251 MG胶质母细胞瘤细胞(图5d)，对PPAT缺失或GLS1过表达敏感；相反，GLS1耗竭或PPAT过表达并不能持续增加这些细胞的AIG。相反，PPAT/GLS1比值低的细胞如HCT116结直肠癌细胞（图5e）和HSC-60胃癌细胞（图5f），PPAT耗竭或GLS1过表达对AIG具有促进作用（HCT116）或没有影响（HSC-60），而GLS1耗竭或PPAT过表达显著抑制了两种细胞系的生长。接下来，检测在生理培养基中培养的这些癌细胞系是否对CB-839敏感，结果显示在生理条件下CB-839只有对HCT116大肠癌细胞（图5m）和HSC-60胃癌细胞（图5n）生长具有显著抑制作用，表明胃肠来源的癌细胞基本上依赖于谷氨酰胺的回补。总体而言，谷氨酰胺的调节可能对多种癌症具有治疗价值，其潜在的抗肿瘤作用可能通过内源性GLS1和PPAT的表达水平来预测。

PPAT-GLS1平衡影响细胞和小鼠的癌症恶性程度，同时作者检测了肺、脑或神经内分泌癌症患者单组群PPAT和GLS1基因表达与总生存率的关系。在每个队列中，PPAT高表达的个体预后明显差于PPAT低表达的个体，而GLS1低表达的个体往往较GLS1高表达的个体预后差，这些差异在神经内分泌癌症患者中最为显著。随后，作者对1.1万名癌症患者队列的所有代谢酶进行综合荟萃分析，在这些合并的癌症队列中，发现嘌呤从头生物合成途径的许多酶在其基因表达水平和总体存活率方面具有较高的危害比（HR）（图6a）。而在随机效应模型和固定效应模型中，PPAT的HR在组织特异性队列中都非常高，如肺癌、乳腺癌、脑癌、造血癌、神经内分泌癌、肝癌或胰腺癌队列（图6b），而除结直肠癌外，GLS1的表达与其他癌症的预后均无显著相关性。但在神经内分泌癌中，PPAT和GLS1的表达分别与预后不良（HR = 5.21）或预后好（HR = 0.38）显著相关（图6b）。PPAT/GLS1比值的影响略小于单独使用PPAT的影响，这表明PPAT的正面作用和GLS1对HR的负面作用并非一一对应。在细胞、小鼠、人类队列研究的观察结果表明，PPAT-GLS1平衡调节细胞增殖和恶性肿瘤，而PPAT的表达水平是许多癌症预后的有力指标。

PPAT表达与神经内分泌癌的不良预后显著相关引起研究人员对SCLC（小细胞肺癌）的关注，SCLC患者RNA测序结果显示肿瘤中PPAT的表达高于正常组织，而GLS1的表达低于正常组织（图7a）。Kaplan-Meier分析显示肿瘤组织中PPAT高表达个体的预后明显差于其低表达个体的预后(图7b)。核苷酸从头合成途径中的限速酶磷酸核糖焦磷酸合成酶2（PRPS2）的表达也存在类似模式，其表达受c-Myc调节（图7c）。相反，UMP合成酶（UMPS）（图7d）、嘧啶合成限速酶和GLS1（图7e）的表达均与SCLC患者预后无关。接下来作者用特定的shRNA将三种SCLC细胞系（MS-1-L、STC-1和SBC-3）PPAT耗竭，并研究其对3-D培养基中细胞生长的影响。结果显示，PPAT的耗竭抑制了三种细胞系的AIG（图7f-k），以抵抗其shRNA介导的敲除方式强制表达PPAT来逆转SBC-3细胞的这种作用（图7j, k）。GLS1的过表达也抑制了SBC-3细胞的AIG（图7l-m）。综上，PPAT表达与SCLC患者预后不良以及PPAT耗竭抑制SCLC细胞系非依赖锚定生长的强相关性表明PPAT可能是SCLC新的治疗靶点。

糖代谢在癌症中被重塑，除Warburg效应的碳转移外，氮转移在癌症恶性进展中也起着关键作用。谷氨酰胺的氮从回补途径转移到TCA循环再到核苷酸生物合成，这种转移由GLS1和PPAT控制，降低PPAT/GLS1比值可以抑制多种癌症的肿瘤生长。PPAT和GLS1都是控制来自谷氨酰胺的氮利用的决定性因素，它影响着体内外的恶性转化效率。本研究关于细胞和小鼠及来自人类队列的综合荟萃分析结果表明，谷氨酰胺向核苷酸生物合成的代谢趋同可能是人类癌症恶性进展中几乎普遍存在的过程（图8）。荟萃分析显示PPAT在所有代谢酶中与恶性肿瘤相关性最强，是决定性的预后标志物，尤其在包括小细胞肺癌(SCLC)在内的神经内分泌癌中，PPAT缺失抑制SCLC生长。因此，谷氨酰胺转运可能是恶性肿瘤进展所必需的，而调节氮代谢是SCLC治疗的潜在途径。总之，本研究作者明确了控制谷氨酰胺代谢命运的关键因素及不同器官肿瘤对这些因素的依赖，为探索不同的癌症治疗方法奠定了基础。

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