多糖蛋白结合疫苗中残留氰化物的检测

2020-07-22 14:59:04, 刘辉 北京普立泰科仪器有限公司


多糖疫苗，例如流感疫苗，流脑疫苗，肺炎疫苗等，在预防侵袭性疾病方面有显著效果。但是，这类疫苗，对于易感高发人群却不起作用，在2岁以下儿童、老年人以及有免疫缺陷的人体内无法激发有效免疫应答。因此，20世纪80年代起开发了多糖-蛋白结合疫苗。

具有医学价值的多糖在和蛋白结合之前需要进行活化和衍生，最早采用溴化氰活化多糖的方法，用作和各种配体进行结合。这种方法对蛋白质的构象及性质会产生一定的影响，因此，使用受到一定的限制。氰基硼氢化钠还原法是蛋白质固化的新方法，其使用条件比较温和，对蛋白质天然属性的影响较小或没有影响。为了保证疫苗的使用安全，多糖和蛋白结合原液经纯化后，对总氰化物的残留有限值要求，其使用液中总氰化物的含量必须小于5ng/mL。

而采用药典中氰化物的检测方法，因为蛋白的干扰产生假阳性结果，无法获得有效数据。本文建立了紫外消解-气膜扩散法检测疫苗样品中总氰化物的新方法。该方法是USEPA认可的方法ASTM 7511-09方法，通过紫外消解，在线气膜扩散等技术手段，将总氰化物从复杂基体中分离出来，有效的克服了基体干扰，以更高的精密度检测更低浓度的氰化物。


实验部分
实验设备和试剂
FS 3700氰化物分析系统，由24通道蠕动泵，3090自动进样器，安培检测计，紫外消解器，WinFlowTM软件控制和处理系统，总氰化物分析模块组成。
图1 FS 3700氰化物分析系统

试剂配制如下：
载液：18.2 MΩ去离子水；
接收液：0.1mol/L NaOH；
TA1和TA2试剂：量取55mL浓硫酸于800mL去离子水中，添加20mL次磷酸，并用去离子水定容至1L。


检测方法
方法原理及流路图
ASTM 7511-09方法通过如下的步骤测量总氰化物。首先，液体样品被吸入并注入到一个酸性的载液流中，经紫外光照射，以分解金属氰络合物形成氰化物离子。在酸性条件下氰化物离子生成氰化氢（HCN）气体，并通过一片疏水性的气体扩散膜（GD）扩散进入碱性吸收液中，转变为氰化物离子（CN-）。该氰化物离子通过安培检测器（AMP）进行测量。图2 显示了总氰化物的流路图。
图2 流动注射分析总氰化物流路图

仪器条件及参数设置
取样时间为35s；进样体积为200μL定量环；40%泵速；进样循环时间为120s；六通阀切换时间为35s；检测器信号采集频率为1Hz。


结果和讨论
工作标准曲线
配制0，10，20，40，60，80，100ppb浓度范围标准曲线，以峰高做积分，一次线性相关系数为R2=0.9993，标准曲线和谱图如图3，图4所示。
图3 0-200ppb标准曲线谱图

图4 0-100ppb标准曲线

样品检测结果
采用本方法检测三个样品，并加标回收，其结果列于表2和表3，其中S1为流感疫苗样品，S2为流脑疫苗样品，S3为结合原液经2倍稀释，S4为51mg/mL标准溶液经1000倍稀释。实际样品检测结果具有很好的重现性和加标回收结果。


结  论
ASTM 7511-09方法检测总氰化物，试剂配制安全简单，样品检测快速准确，采用膜扩散技术可以有效屏蔽蛋白的干扰，采用酸化和紫外消解获取氰离子，是检测多糖蛋白结合疫苗中氰基硼氢化钠残留的有效手段。
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