【基因组学】比较基因组杂交技术 aCGH 之应用大观

上期我们介绍了比较基因组杂交 aCGH 技术，本文着重整理了国外 aCGH 技术在生殖健康领域的成功应用。

出生缺陷筛查

出生缺陷是指婴儿出生前，在母亲的子宫内就发生了发育异常。

数据显示，我国出生缺陷总发生率约为 5.6%，属出生缺陷高发国家，其中出生缺陷者约 30% 在 5 岁前死亡，40% 成为终身残疾。出生缺陷病种繁多，目前已知的至少有 8000-10000 种，染色体异常是导致出生缺陷的重要原因之一，产前诊断与筛查技术是有效预防出生缺陷的关键手段，其中染色体核型检查目前是最主要的检测手段。但传统核型分析的分辨率较低，大量的染色体微缺失/微重复异常引起的遗传疾病需要通过高分辨率染色体芯片分析来进行检测。

2012 年的《新英格兰医学杂志》指出，在产前诊断过程中使用染色体芯片分析相比传统核型分析可以提高异常胎儿的检出率 [1]。得益于无创产前诊断的快速发展，13/18/21 三体的检测变得更加成熟和方便，但是由于无创产前诊断较高的假阳性率和微缺失/微重复检测的局限性，对于 35 岁以上高龄、双胎或各类超声异常、父母双方或家系成员中有某些遗传病或先天畸形者、唐氏筛查高危或无创染色体筛查阳性者等等情况，染色体芯片是最佳的检测方案。

根据美国妇产科医师学会和美国母胎医学学会的妇产科医师临床指南，如果患者在超声检测时发现重大的胎儿结构畸形，则需要用 CVS（绒毛膜活检） 或羊水穿刺来进行染色体微阵列芯片检测。染色体微阵列芯片可以在 6% 的核型结果正常的胎儿中发现具有临床显著意义的染色体异常，因此，染色体微阵列芯片应被做为主要检测（替代常规核型分析）推荐给因为超声检测指示胎儿结构畸形而进行产前诊断的患者。另外，对因为任何指征而接受了侵入性诊断检测的女性都应当提供染色体微阵列芯片分析。

指南中还指出，染色体微阵列分析是一项既可以识别主要染色体非整倍性又可以检测常规核型分析因为太小而无法检测到的亚显微变化的技术，它可以识别几乎所有通过核型分析可以检测到的异常（除了平衡易位）。

另外，染色体微阵列芯片的一大优势是快速的周转时间，可以直接用于未经培养的细胞，或用于培养细胞，大大缩短了从取样到出报告的时间（约 3-7 天），可以更早做出对疾病的诊断 [2]。

儿童智力障碍、发育迟缓、自闭症、先天性多发畸形等复杂儿科疾病的诊断

儿科中智力障碍（Intellectual Disability, ID）、发育迟缓（Developmental Delay, DD）、自闭症（Autism Spectrum Disorders, ASD）和先天性多发畸形（Multiple Congenital Anomalies, MCA）等疾病是全球范围内严重影响儿童健康的重要因素。儿童智力低下的发病率约 3%，自闭症的发病率大约 1%。由于这些疾病经常是很多综合征疾病的非特异性症状，因此诊断病因非常困难。这些疾病中大约有 20% 是染色体引起的。尽管传统的核型分析、FISH 等方法部分提高了病因检出率，但是仍有 50% 的患者病因不明 [3]。

美国医学遗传学会、加拿大医学遗传学会和国际细胞遗传标准化联合会的专家 [4] 都推荐染色体芯片分析技术作为上述疾病的首选检测方法。aCGH 用于各类儿科遗传病研究时具有高检出率、高分辨率和高敏感性的优势，广泛适用于不明原因的智力障碍、发育迟缓等精神障碍、临床怀疑的染色体综合征类疾病。aCGH 的检出率（15-20%）与常规染色体核型的 3% 相比高出 5 倍，大幅提高了诊断率。2009 年 Hochstenbach 等人利用回顾性分析的方法在 36325 例疑似不明原因发育迟缓智力障碍的患儿中通过 aCGH 检出 19% 的致病性 CNV [5]。

反复自然流产、死胎的病因诊断

临床上将连续 3 次或 3 次以上的自然流产称为反复自然流产。

据报道，在所有备孕夫妻中大约有 1% 的反复自然流产发病率，它的病因非常复杂，其中 40-80% 病因不明，称为不明原因反复自然流产。当妊娠满 20 周后，胎儿在子宫中死亡的称为死胎，在美国每 160 个新生儿中就有 1 个死胎。

无论是不明原因反复自发流产还是死胎都严重威胁了孕妇的身心健康，而遗传异常是重要因素。染色体畸变在孕早期很常见，大约 67% 的隐秘性自然流产、50% 的孕早期内确认的流产以及 5% 的死胎是细胞遗传异常导致的。染色体异常也较常见于多次流产和胎儿结构畸形的情况，据报道显示，96% 的染色体异常是非整倍体和多倍体引起，主要包括性染色体、13\16\18\21\22 号染色体。

目前检测流产和死胎组织染色体异常的主要方法是核型分析和荧光原位杂交法，但是传统的核型分析受到多方面的限制导致检测效能低下，如死胎组织培养成功率低、细胞培养费时费力、不能检出染色体微缺失微重复等,而荧光原位杂交在临床上只能做为筛查手段而非最终诊断。美国新英格兰医学杂志和中华医学遗传杂志等连续发表多篇关于染色体芯片分析用于流产物和死胎检测的论文，指出染色体芯片分析在流产物和死胎遗传病因检测上有着明显的优势，具有较好的临床价值。美国妇产科医师学会（ACOG）和美国母胎医学学会（SMFM）的指南提出，因为染色体微阵列分析不需要分裂期细胞，无需进行细胞培养，是死胎或死产检测的最佳方法 [2]。

三代试管婴儿胚胎植入前遗传诊断与筛查（PGD/PGS）   

尽管 试管婴儿（In Vitro Fertilization，缩写为IVF）技术已经在生殖医学领域应用了很多年，但 IVF 的成功率依然不是非常高。根据最近的数据显示，对于 35 岁以上接受 IVF 的女性，从胚胎开始大约只有 32-33% 比例可以成功发育为新生儿。非整倍体是引起 IVF 失败的主要原因，尤其是在高龄女性群体，因此非整倍体检测将是提高 IVF 成功率、减少流产率的关键手段。aCGH 技术在非整倍体检测方面扮演着越来越重要的角色。

Hellani 等对 8 例反复 IVF 失败患者的 41 枚胚胎进行基于 aCGH 的产前遗传筛查（PGS）检测，发现 60% 的胚胎存在染色体异常，6 例患者接受了正常胚胎移植，其中 5 例获得妊娠，开辟了 aCGH 技术在 PGS 中应用的新篇章。

Hodes-Wertz 等对 287 对复发性流产夫妇的 2282 枚胚胎进行 aCGH-PGS 筛查后，选取整倍体胚胎进行移植，明显降低了早期流产率（6.9%/33.5%）[6]。

不久前台湾彰化基督教医院的研究团队采用了操作流程上改进的 aCGH 技术进行 PGS，研究人员在第 5 天对胚胎取样，经过 9 个小时的 aCGH 对胚胎活检样本进行分析筛选，在第 6 天进行单个鲜胚移植。通过优化 aCGH 技术的 PGS，他们成功地将临床妊娠率提高到 87.5%，持续妊娠率提高到 62.5% [7]。

针对产前遗传筛查和产后遗传诊断的研究，安捷伦与美国贝勒医学院合作，提供贝勒医学院系列的产前和产后微阵列芯片。这些芯片由贝勒医学院的专家设计并优化，可靶向与产前和产后研究相关的区域。探针组合在疾病相关区域加密，可检测拷贝数变异和亚显微结构染色体改变，帮助研究者找到更相关的疾病相关畸变。在 CGH 探针的基础上增加 SNP 探针，还能够检测中性拷贝数变异，例如杂合性缺失（AOH）和单亲二倍体（UPD）。国际标准化细胞生物学诊断芯片联盟 ISCA 也与安捷伦合作共同开发了一系列 aCGH 和 CGH+SNP 芯片，已在国外用于 130 多种遗传疾病的诊断，多年来为产前筛查和产后诊断提供检测，积累了数千例样本，并在全世界范围内开展广泛的合作。

针对产后应用，安捷伦科技公司（纽约证交所：A）于2017 年 3 月推出首款产后比较基因组杂交（CGH）微阵列芯片：GenetiSure Dx 产后微阵列芯片。致力于更早、更准确地检测出遗传异常。该芯片的适用范围包括儿童和成人的发育迟缓、智力障碍、自闭症、先天性畸形及畸形体征的遗传检测。

在植入前遗传诊断和筛查方面，安捷伦的 GenetiSure 辅助生殖染色体筛查解决方案已成功应用于辅助生殖领域的单细胞非整倍分析。此工作流程可以在 24 小时内鉴定单细胞中的非整倍体，对胚胎中低至 5 Mb 的分辨率或部分嵌合体的染色体畸变进行准确评估，有利于研究人员获取可靠的高分辨率数据。同时创新性的杂交策略设计使得一个样本可以同时比较男性参比样本和女性参比样本，很好的解决了传统芯片技术对大量性染色体异常检查准确性低的问题。

图 1. 专用的分析软件直接查看和导出报告

安捷伦 CGH 微阵列芯片是全球广受用户认可的全基因组染色体分析芯片。凭借可用于多种 CGH 应用的简单易用型目录产品以及经济、灵活的定制服务，安捷伦 CGH 解决方案正在努力更好地满足临床遗传实验室研究项目不断变化的需求。

注意：本文提及的产品目前在中国仅限于科学研究使用

参考资料：

1. Wapner RJ, Martin CL, Levy B, et al. Chromosomalmicroarray versus karyotyping for prenatal diagnosis. N Engl J Med, 2012; 367:2175-84.

2. ACOG Guidelines: Practice Bulletin 162,Prenatal Diagnostic Testing for Genetic Disorders, Number 162, May 2016

3. 应用微阵列技术进行中国儿童发育迟缓/智力低下病因学研究进展，第一情报 ---生物与医药，2011-9-20，彭建新

4. Consensus Statement: ChromosomalMicroarray Is a First-Tier Clinical Diagnostic Test for Individuals withDevelopmental Disabilities or Congenital Anomalies, Am. J. Hum. Genet 2010, 86:749–764

5. Array analysis and karyotyping:workflow consequences based ona retrospective study of 36,325 patients withidiopathic developmental delay in the Netherlands. Eur. J. Med. Genet. 2009,52:161–169.

6. 韩丹，陈大蔚，曹云霞，等. Array-CGH 技术在胚胎植入前遗传学诊断中的应用进展［J/CD］. 中华临床医师杂志：电子版，2015，9（6）：976-979.

7. A pilot proof-of-principle study tocompare fresh and vitrified cycle preimplantation genetic screening bychromosome microarray and next generation sequencing, Molecular Cytogenetics, 2016, 9:25

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