生物标志物分析——尿液中的秘密

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如果需要检测人体或动物的代谢产物，都要选取合适的样品。一般用于人体或动物的代谢样品有很多，比如血液、组织、尿液、呼吸气等。在这么多样品中，尿液是一种比较理想的样品类型，其中优势有很多，一方面，量大易得，毕竟每天每个人都会产生；易于保存，采样过程是侵入式的，对患者比较友好；另外，尿液的前处理相对于其他形式，比如血液或组织，更为简单快捷，一般只需要做溶剂萃取，然后做个衍生化就可以进样了。

从检测和研究的效果来说，由于尿液是很多代谢产物的最终排除方式，其中的化学组成反映了体内的代谢过程，可以反映很多种疾病或身体异常情况。所以尿液自然就成了代谢组学里面很受欢迎的一类样品了。

很早以前对尿液中的代谢物质进行化学检测基本用的还是GC-MS，近年来随着全二维气相色谱的发展，很多研究开始采用GCxGC的方式，这种分离效果更出色的技术进一步扩展了大家的认识，揭示了尿液中隐藏的人体健康信息。

来自南非的科学家Luiers和Loots [1] 深入研究了尿液中跟肺结核（Tuberculosis，TB）相关的代谢生物标志物（主要是有机酸）。他们采用的是非常标准的代谢生物标志物分析流程，我们可以借此介绍一下，主要过程见下图。

首先选取适当的患者组和控制组收集尿液，对样品进行液液溶剂萃取和衍生化（根据分析对象的不同性质，有不同的标准化方法），再进样到GCxGC-TOFMS系统，然后对结果进行初步的数据预处理（峰寻找，解卷积，定性等，一般全二维数据分析软件就可以完成），接下来是关键的统计分析过程，需要对大量的数据进行一系列处理，包括归一化，数据过滤和筛选，再应用多种生物统计学和化学计量学方法，最终得到了12个与肺结核患者相关的生物标志物。

通过确定这些标志物，还可以推断出宿主-结核杆菌之间发生的一些特异性代谢过程。对于肺结核患者来说，特别显著的变化是异常的脂肪酸和氨基酸代谢，比如色氨酸，苯基丙氨酸和络氨酸产生了较明显的变化，这些信息有助于我们了解结核杆菌是如何抵抗人类体内的巨噬细胞及其他免疫攻击而成功在体内存活的，也为之后的有效治疗提供了依据。

在目前的肺结核临床治疗中，无效治疗和复发的情况比例还不少，大家对其原因也了解不多。在另一篇文章里 [2]，这个团队又研究了肺结核治疗差异的患者中的代谢过程，通过对经过成功治愈和未治愈患者在治疗前和治疗后的代谢物检测，筛选出了这两组患者间的差异性生物标志物，治疗失败者尿液表明，某些产物含量急剧升高，表现出长链脂肪酸β氧化异常特征，同时短链脂肪酸减少，反映了线粒体三功能蛋白有缺陷，另外一些代谢物指标表明肠道微生物群产生了一定程度的紊乱。

这些信息反映了不同结核菌患者体内的免疫系统和结核菌的相互作用过程，为今后开发更有效的治疗方法及在初期针对性制定治疗策略奠定了基础。

Weinert[3]等德国科学家对GCxGC-qMS在代谢物分析中的应用效果进行了评估。由于qMS相对比较普及，如果可以配合GCxGC进行常规的代谢组学分析，那无疑可以极大促进这种新方法的推广。但由于qMS扫描速率偏低，灵敏度也不如TOF，其性能会受到一些限制。这篇论文详细验证了高速qMS（20000u/s）的信号质量，每个峰包含的数据点数量，数据重复性，长期稳定性，检测限等重要指标。最后证明GCxGC-qMS也是一种实用的技术，绝大部分技术指标都符合代谢组学常规分析的要求，在资源有限的情况下可以用于某些代谢组学应用。

另一组德国团队[4] 关注了尿液中的芳香胺类物质，这些物质广泛存在于烟草中，是一种致癌物，进入到吸烟者的血液后，最终聚集在膀胱并随尿液排出体外。一些证据表明芳香胺是导致膀胱癌的因素之一。这项研究采集了吸烟者和不吸烟者的尿液，进行常规的萃取和衍生化后通过SPME进样到GCxGC-qMS系统，对16种目标芳香胺物质进行方法优化，并对实际样品中的目标物进行定量分析。可以发现，吸烟者尿液中的芳香胺种类和含量远大于未吸烟者。

Vasquez等[5] 开发了针对儿童尿液中有机酸分析的GCxGC-qMS方法，婴儿和儿童尿酸症可以引发一系列神经性疾病。这项研究得到的成果有助于我们更了解尿酸症的形成原因和致病机理，并提供更准确的预防和诊断手段，。

类固醇激素是人类体内非常重要的化学物质，对很多生理过程起到关键的调节作用。Bileck等[6] 利用GCxGC-TOFMS检测了人类尿液中类固醇激素，并对未知物进行了定性筛查[6]，证明了这种技术既可以完成高效的常规人体激素检测，也可以用于科研应用，阐明类固醇激素的代谢机理或发现新的类固醇物质及代谢产物。

另外，来自英国和德国的联合研究团队[7] 对动物（鼠和猪）的尿液以及其他一些组织及血清等进行了生物标志物分析。采用GCxGC-qMS方法，通过标样比对和质谱库（NIST）搜索，确定了样品中的典型生物标志物。

相比传统的GC-MS，全二维方法无论在检测到的标志物数量还是灵敏度都有显著提高，另外由于分离更好，消除了一维方法中存在的很多共馏出干扰，定性结果更准确可靠。总体来说，全二维气相色谱比一维GC-MS更适合进行代谢组学分析。

参考文献

[1] L. Luies, D.T. Loots, Tuberculosis metabolomics reveals adaptations of man and microbe in order to outcompete and survive, Metabolomics, 12 (2016) 40

[2] L. Luies, J. Mienie, C. Motshwane, K. Ronacher, G. Walzl, D.T. Loots, Urinary metabolite markers characterizing tuberculosis treatment failure, Metabolomics, 13 (2017) 124

[3] C.H. Weinert, B. Egert, S.E. Kulling, On the applicability of comprehensive two-dimensional gas chromatography combined with a fast-scanning quadrupole mass spectrometer for untargeted large-scale metabolomics, J.Chromatogr. A, 1405 (2015) 156

[4] X. Lamani, S. Horst, T. Zimmermann, T.C. Schmidt, Determination of aromatic amines in human urine using comprehensive multi-dimensional gas chromatography mass spectrometry (GCxGC-qMS), Anal. Bioanal. Chem. 407(2015) 241

[5] N.P. Vasquez, M. Crosnier de bellaistre-Bonose, N. Lévêque, E. Thioulouse, D.Doummar, T. Billette de Villemeur, D. Rodriguez, R. Couderc, S. Robin, C.Courderot-Masuyer, F. Moussa, Advances in the metabolic profiling of acidic compounds in children’s urines achieved by comprehensive two-dimensional gas chromatography, J. Chromatogr. B, 1002 (2015) 130

[6] A. Bileck, S.N. Verouti, G. Escher, B. Vogt, M. Groessl, A comprehensive urinary steroid analysis strategy using two-dimensional gas chromatography – time of flight mass spectrometry, Analyst, 143 (2018) 4484