2020-03-14 19:38:22, Celine Chang Cytiva(思拓凡)
WB 答疑
哥家 Western blotting(以下简称 WB)系列产品促销已经在 4 月的春风中拉开帷幕(猛戳链接「G 然相识,E 路相陪,W 大步流星,B 有惊喜」),热线上小伙伴们的咨询热情也是一路飙升。小电泳,大智慧。哥家为您提供 WB 全套解决方案(见图 1)。
WB 的实验流程为:样品制备-凝胶电泳-转印-抗体孵育-检测分析,今天小编特意汇总了在 WB 这 5 个关键步骤中最为常见的 19 个问题,希望小伙伴们能够顺顺利利的做 WB 实验。
图 1. GE 蛋白免疫印迹相关仪器和耗材产品
样品制备
不同类型的样品,均有对应的蛋白提取方法,可以对号入座。哥家为大家准备了各种蛋白酶抑制剂、核酸酶以及样品研磨、多种类型蛋白抽提缓冲液试剂盒、样品脱盐和 Clean-up 试剂盒等。
《蛋白电泳免疫印迹产品指南》
图 2. 不同细胞和组织样品提取方法概览
1
低丰度蛋白是否需要预处理?
低丰度蛋白建议在 WB 分析前使用亲和等方法进行预富集,如可以采用 Mag sephorase TiO2(500 µL 货号:28944010)对磷酸化蛋白进行免疫沉淀富集;或反过来,去除几种高丰度蛋白,如血浆中的白蛋白和 IgG(离心柱货号:28948020)等,以提高低丰度蛋白含量。
如果珍贵稀少的样品需要同时提取 DNA、RNA 和蛋白,请选择 illustra™ triplePrep™ Kit(50次 :
28942544;10次:28945434)。
tripleprep 50
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2
样品如何脱盐和去除小分子杂质?
可以使用脱盐柱,一步进行样品的脱盐和缓冲液置换。但是,基于分子筛的脱盐和缓冲液置换可能会造成样品稀释,而好的电泳结果往往需要较高的蛋白浓度。因此,也可以使用超滤管进行浓缩和缓冲液置换。
针对高盐且浓度低的样品,可以直接选择哥家的 PlusOne SDS-PAGE Clean-Up Kit(货号:80648470),通过沉淀法去除去污剂、盐、脂质、酚类和核酸。
3
WB 实验需要定量,选择内参还是总蛋白做归一化?
使用总蛋白定量效果更好:
1)由于极少受到各种条件,如细胞处理和培养条件以及操作的影响,因此更可靠。
2)操作更方便,通过 QuickStain 蛋白预标记试剂盒(货号:RPN4000),使用荧光标记染料 Cy5 将蛋白样品预先标记上红色荧光,二抗孵育后直接使用 Typhoon 成像,无需加入 ECL 底物。同时在电泳和转印结束后,可分别对凝胶和膜成像,判断电泳和转印情况,监控实验流程。
3)荧光检测的方法具有更宽的检测范围和更强的蛋白信号。
凝胶电泳
哥家电泳仪:带有氧化铝陶瓷短板而散热功能更佳(散热能力是普通玻璃板 40 倍)的 SE250/260 小型垂垂直电泳仪,内置热交换和制冷功能;真正集凝胶灌制、电泳和印迹于一身的 mini VE 迷你型垂直电泳仪;兼容双向电泳的 SE600 标准垂直电泳仪(18 × 16 cm),可外接循环水浴。
4
什么情况下,该选择梯度胶?
聚丙烯酰胺凝胶中,小分子量蛋白移动快,更容易分离,而大分子量蛋白移动慢。当有多种分子量范围分布很宽的蛋白需要在同一张胶上进行分离,可能出现小分子量蛋白快跑出胶,而大分子量蛋白仍未得到有效分离。
此时建议使用梯度胶,小分子量蛋白运动至在胶浓度更高的底部(正极),同时大分子量蛋白在顶部有更好的分离。如下图:
图 3. 选择最佳的丙烯酰胺凝胶浓度达到高效的蛋白分离
5
在进行 WB 电泳时,是否需要加入 Marker?能够在最后的膜上曝光出来吗?
Amersham 预染分子量彩虹 Marker(全分子量 12 KD - 225KD,货号:RPN800E,火热促销 ing)可以在电泳过程中观察蛋白的运动,同时评估不同分子量蛋白的转膜效率。当然,还可以用于蛋白分子量的计算,利用哥家 IQTL 软件自带的分析功能,可对目的蛋白的化学发光成像结果和白光检测的预染 Marker 结果进行叠加,对 Marker 进行拟合(相对迁移距离 Rf 和分子量的 Log 值),计算目标蛋白分子量。
也可以选择 ECL DualVue 免疫印迹标准 Marker(货号:RPN810),包含 3 种 15k-100k 预染标记蛋白和 7 种 15k-150k 分子量标签重组蛋白。重组蛋白含有能够和 SRP 结合的多肽标签,S-protein-HRP 结合物在孵育一抗或二抗的过程中同时加入,通过和 ECL 底物反应后释放化学发光信号,因此条带能够通过胶片或 CCD 成像设备检测。
荧光多重检测方法中,可以选择能够通过 Cy3 和 Cy5 双通道检测的 ECL Plex 彩虹荧光 Marker(货号:RPN850E 或 RPN851E),具有更宽的线性范围。
转印6
各种 NC 和 PVDF 膜,傻傻分不清楚?
请参考下表:
表 1. NC 膜和 PVDF 膜差异
7
如何选择不同的转印膜的孔径?
标准印迹膜的孔径是0.45 µm,适合检测分子量>20kDa 的蛋白,可以满足大部分实验需求。0.1 µm 孔径适合检测分子量<10kDa 的蛋白,0.2 µm 孔径适合检测分子量在 10-20kDa 之间的蛋白。
8
转印滤纸如何选择?
GB005(促销货号:10426981,200*200 mm)较厚,适合用于半干转印,利于避免转膜过程中胶干掉;
3 MM 纸(促销货号:3030-861,200*200 mm)是经典的用于湿转的印记滤纸,湿转也可以选择 GB003,厚度更大。
另外,GE 还提供 Amersham「 三明治」 印迹膜/ 滤纸组合,小伙伴们省去了分别剪裁的功夫。
9
转膜时候,膜和胶的相对位置如何,到底哪一个在正极?
通常情况下,转膜过程中,膜在胶的正极。蛋白带有负电荷,但不再是因为结合 SDS,而是因为常用的 Towbin 转膜缓冲液 pH 是 8.3,高于大部分蛋白等电点,造成带负电蛋白往阳极运动。如果某些蛋白的等电点高于缓冲液 pH 而带有正电荷,例如组蛋白和核糖体蛋白,则最好在阴极放一张膜。
图 4. 蛋白转印三明治示意图
10
手册中推荐转印缓冲液组成,如果是大分子蛋白,建议加入 0.1%SDS 和 10% 以下的甲醇;而小分子量转印,不要含 SDS,将甲醇量提高到 15-20%,是为什么?
事实上,SDS 的存在会阻碍蛋白与膜的结合,将胶在转膜缓冲液中预先平衡 15-30 min,有利于将 SDS 从胶上去除。但是,对于只能部分溶解的高分子量蛋白(容易在胶里形成沉淀)或含有过量的疏水氨基酸的样品,可以在转膜缓冲液中加入低浓度 SDS(0.02%-0.1%)促进蛋白转膜。
甲醇本身促进蛋白结合到膜(尤其是 NC 膜)上,部分是由于其去除了和蛋白结合的 SDS,因此加入到转膜缓冲液中。但是,甲醇可能会造成胶收缩,从而阻碍蛋白尤其是大分子量蛋白从胶上转移,且大分子转移时需要一定量的 SDS 促进溶解。因此,针对大分子量蛋白转印,需要将甲醇量降低至 10% 或以下,同时延长转膜前胶和缓冲液的预孵育时间,改善转印效率。
小分子量蛋白转印反之。
11
湿转和半干转印,如何选择?
请参考下表:
表 2. 湿转和半干转差异
未完待续…
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