专家解答| 关于非生物胁迫的37个问与答

景杰生物/报道

本文为《园艺研究》作者分享会【园艺作物非生物胁迫】的文字整理版，本次作者分享会邀请了西北农林科技大学马锋旺教授，管清美教授，龚小庆副教授，徐记迪副教授，毛柯助理研究员，孙逊讲师，董庆龙博士、张德辉博士、陈鹏翔博士、耿达立博士、牛春东博士和李雪薇博士与作者交流群中2200多人进行了热烈的交流讨论。

1、干旱胁迫下某个转录因子表达量下调，是否可以初步认为该基因负调控植物响应干旱胁迫呢？最近阅读发现，过表达某个干旱胁迫后表达量下调的转录因子也是可以提高抗旱性的，但该文章未明确机理。这种现象是否矛盾呢？

答：干旱胁迫下转录因子表达量下调，就认为该基因负调控植物响应干旱胁迫是不完全正确的。转录因子应激表达较快，有些转录因子在胁迫0.5小时即达到表达峰值，如果在0.5小时后再取样检测表达量，就会误以为转录因子表达量无变化或下调，因此，鉴定转录因子是正调控还是负调控植物响应干旱胁迫不能仅分析其表达量，还应进行更为深入的遗传转化、调控机制研究。问题中提到了转录因子在干旱胁迫后表达量下调，而过表达该转录因子后又可以提高植株抗旱性，可能是由于最初检测转录因子表达量时取样时间过晚，错过了其表达高峰，转录因子早期激活下游基因后，由于反馈调控回复至正常水平甚至下降也是有可能的。

2、通过前期生物信息学分析，在石榴中发现了一个拟南芥胁迫响应基因RD26的同源基因NAC，盐胁迫后在石榴根和叶片中高表达，克隆并转拟南芥后做了平板实验，发现降低了种子发芽率，50mM 的NaCl胁迫后发芽率不到30%，比对照组野生型的长势更差，是否说明该基因不具有增强耐盐性的功能，还可以从哪些方面进一步去验证了？

答：异位表达石榴RD26在拟南芥在50mM NaCl处理后萌发率降低，有可能是参与到ABA信号途径中，导致在NaCl处理下，转基因植株种子中ABA含量更高，从而造成了转基因植株种子萌发率降低。可以检测拟南芥转基因植株ABA合成或者代谢途径和信号转导途径相关基因的表达水平以及种子中ABA的含量来解释这一现象，进一步验证还可以做ABA和NaCl浓度梯度检测转基因种子和幼苗下的表型，比如根伸长、存活率等来实验综合评价该基因的功能。

3、是否关注过磷酸化，乙酰化，糖基化等蛋白修饰在抗逆等方面的研究？

答：磷酸化、乙酰化、糖基化等蛋白修饰在植物抗逆等方面的研究我们也一直有所关注。蛋白修饰是影响蛋白功能的非常重要的因素，对于不同的蛋白，有的因修饰而激活，有的因修饰而被抑制。在植物抗逆响应中，蛋白质的修饰也是一个非常有意思的研究点。在蛋白组测序的基础上，现在也可以借助测序的手段来了解植物在响应逆境过程中这些修饰化过程发现的变化。不同的时间点，或是不同的处理过程中，体内的蛋白状态是如果进行变化去响应逆境胁迫，继而从中可以挖掘到一些重要的蛋白质，它们可能是通过自己修饰化状态的改变来参与植物逆境响应。这个在模式作物如拟南芥或者水稻等都有报道，同时业内有非常多的公司可以辅助进行相关的测序分析工作。从常规的基因功能研究上看，磷酸化、甲基化、泛素化等都是特别热门的研究点。磷酸化，可激活也可以抑制靶基因；泛素化，一般降解；类泛素化，可激活也可抑制，抑制研究在人类细胞研究中常见。例如，由泛素小分子参与的泛素化过程多半是会介导蛋白质降解；类泛素小分子像SUMO这种的，可能会激活蛋白的功能。这些都需要在具体的研究中摸索解答。简言之，蛋白修饰在植物抗逆方面的研究其实是非常多的，大家可以根据自己的研究，有针对性的查阅文献，寻找深入的点。

4、一篇文章中可以只做重金属镉胁迫与干旱胁迫两种胁迫吗？

答：可以的。一篇文章中做多少胁迫，做哪几种胁迫应该根据研究的规划而决定，一个故事的完整性不在于做多少胁迫，而在于有始有终，在这个故事中发现了什么问题、解决了什么问题。其实做得比较深入的文章，大多只会围绕一种胁迫来做；研究做得比较好的团队也有其专长，都是比较专注的。长久而专一的研究，才能出比较好的结果。

5、能否请教授们分享一下非生物胁迫相关研究在撰写国家自然科学基金方面的写作思路和技巧？

答：国家自然科学期的撰写，相信大家在网上也能找到非常多的大牛的分享。在此，我们仅说一点个人体会。首先在选题上，应该是非常明确的“1个点”或是“1条线”的研究，注重由园艺生产实际问题转向科学研究问题的这个凝练过程。体现在题目上，多是“XX基因在XX中的功能研究”、“由XX基因介导的XX途径在XX中的功能研究”之类的，非常具体。从长远上看，最好是结合自己多年的积累申请，有专一性的研究方向，做持之以恒的研究与创新。每年申请在不同的领域内跳来跳去，这点也是很忌讳的，不要认为专家们不了解你的研究。对刚开始申请项目的青年人而言，我们觉得最好的就是结合自己长久的研究背景抓住某个点来撰写项目本子，不建议像大海捞针一样从“捞”的这个行为开始。在立项依据这一部分，要求比较精练，不要像写文章或是写论文的前言一样，泛泛的一大堆。所引用的参考文献不要超过30篇，近3年内的研究文献比例不能太少。在研究内容上，要思维清晰，对于一些研究手段和方法的基本原理、技术的基本要求要非常理解，所写出来的方案能实现项目的研究目标，不能盲目堆砌技术而与研究内容相背弛。研究内容要适当的深入，不要停留在浅层表面。现在学科研究发展非常快，前几年还有以组学分析为主的项目获批，目前这类的项目在自然科学基金的申请里面可能已经没有了，特别是青年基金、面上基金，基金委也不倾向于批准一个以测序为主的项目。在工作基础上，要注意结合团队的工作，利用可借鉴的地方，或是借助团队已有的研究基础开始自己的项目研究，这都是非常不错的开端。

6、低温冷驯化与低温胁迫有什么区别？如何从分子机制上来理解？

答：低温逆境以零度为界分为冷害（chilling injury）和冻害（freezing injury）。冷害是指０℃以上低温对植物造成的伤害，主要影响植物的光合作用和呼吸代谢等过程，造成植物细胞功能紊乱，使植物生长不正常，甚至停滞。冻害是指０℃以下低温对植物造成的伤害，冻害会造成植物细胞结冰，对植物细胞膜造成机械性损伤，严重时会造成植物死亡。植物在与环境长期的互作过程中进化出一系列的机制抵御低温胁迫造成的伤害。冷驯化（Cold acclimation）是指将植物置于非致死低温一段时间之后，植物抗冻能力增强的过程。在此过程中植物体生理生化各方面都会发生变化，包括细胞膜脂成分的变化。细胞内脯氨酸、可溶性糖、渗透物质及抗冻蛋白的增多等。但是有些植物不能被驯化，如一些热带、亚热带作物。植物感受低温胁迫与冷驯化的分子机制大体相同，都属于低温信号传导，研究其分子机制一般围绕信号通路开展。目前研究的最为深入的低温信号转导途径是CBF/DREB依赖的低温信号通路途径，如ICE1、CCA1等能够通过转录调控影响CBF基因的表达；激酶CRPK1能够在低温情况下被激活，磷酸化14-3-3s蛋白，促进CBFs蛋白的降解；E3连接酶HOS1可以泛素化ICE1，促进其在低温下的降解，进而影响CBF3及其下游COR基因的表达；SIZ1作为SUMO E3连接酶可在低温处理时使ICE1蛋白SUMO化，抑制HOS1对ICE1的泛素化，提高ICE1蛋白的稳定性等等。此外，植物对低温的响应还存在CBF不依赖的调控方式，如HOS9、CSP3等基因能够调控低温胁迫，但是不影响CBF相关基因的表达。

7、如何做干旱胁迫，使用PEG6000模拟还是进行控水？控水应如何操作？

答：关于模拟干旱和控水，这是是对不同实验材料，不同实验目的的不同处理办法。按照我们的惯用处理逻辑，由于PEG中难免存在对植物有毒的低聚分子，因此PEG模拟干旱通常不用于长期处理实验。反之，由于控水需要自然条件配合，在短期（＜1天）处理实验中使用控水显然是难以实现的。因此，两者搭配使用，PEG模拟干旱用作短期处理观察基因表达变化。控水用作长期处理观察表型变化。控水最理想的方案始终是基于土壤水分测量仪的控水设计方案，这能最精确的给出植物所处环境的土壤水势，但土壤水分测量仪价格不菲，因此基于土壤饱和含水量的控制盆重方法也很常用。

8、在木本植物中，对于干旱和寒冷，以及光周期对植物叶片衰老的响应相关机制有过报道不，然后其各部分对于植物花芽分化的直接作用机理有相关文献吗？

回答：是的，均有相关报道。但是如果局限于木本植物中，相关的研究会贫乏许多——由于木本植物研究较少的缘故。仅就果树而言，关于干旱对叶片衰老的报道有：    

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23106234  

关于寒冷对叶片衰老的报道有：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24634439  

关于光周期对叶片衰老的报道有：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21274560

相较于叶片衰老，花芽分化受光周期和低温因素较大而与干旱之间的研究报道较少,这或许是因为在常见果树的花芽分化期难以进行干旱胁迫相关研究的原因。主要常见果树（苹果，梨，柑橘，葡萄）的花芽分化均在秋季启动，冬春完成，这期间植物逐渐转入生长停滞期，需水量下降，很难就干旱对花芽分化的影响进行研究。

关于低温对花芽分化的影响：

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168945215300297?via%3Dihub  

关于光周期对花芽分化的影响：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24876291

9、抗性差异除了结构基因发生变化外，各调控家族是否也有影响？？参与抗性相关的基因家族都有哪些？

答：除了结构基因，调控基因肯定也有响应，而且起的作用更广泛。参与抗性有关的基因太多太多，苹果金冠基因组中，大约有10000个基因响应干旱、5000个响应低温，8000个基因响应高温胁迫。其中转录调控占很大的比例，如MYB，NAC，CBF，WRKY，DREB，HSF等等。具体多少可以参考文献，也可以开展组学研究来筛选，不同物种不同逆境会略有不同。

10、在植物胁迫研究中, 是否考虑植物的遗传背景? 尤其是那些异花授粉植物, 例如pecan。pecan很难获得纯遗传背景的幼苗, 如何消除遗传背景对stress的影响? 由于没有遗传背景一致的seedlings, 又如何避免每次取样产生的伤害对有关基因表达的影响? 请问你们对out-crossing植物做stress研究中, 植物的选材和取样有什么建议?

答：在进行植物胁迫研究时，我们也是会考虑植物的遗传背景的，在有些测序项目中，也常因为背景不一致而引起最终结果并不是很理想。苹果在生产上来说，也是需要配置授粉树的，也是一个遗传背景不一致的水果种类，市售的各品种，通常说的是母本品种，父本并未可知。但是比较幸运的是，苹果存在一定程度的无融合生殖。像平邑甜茶，它的无融合生殖的概率可以达到90%，这也就意味着，在后代植株中，大部分的植株的遗传背景是和母本一样的，只有少部分实生而来的植株会产生实生变异。所以这个材料也是我们在进行研究时用得非常多的一个材料。另一个方面就是采用无性系列的材料，例如构建组培材料并大量扩繁、嫁接等，这样都可以获得遗传背景一致的材料。花药培养从理论上来说也可以获得纯合的单倍体，只是不知道是否适用于pecan。还有一个思路是用相同的父母本杂交而来的后代植物来进行研究，这样所需的时间周期比较长，但是另一方面所有的后代植株遗传组成上起源于同一父母本，它们的遗传背景也就是一致的了。如果实在是无法获得遗传背景相对一致的材料，那么在研究过程中可能只有加大样本量了，以大样本实验得到的数据尽可能的消除遗传背景的影响。最后想说的一点是，植物基因在长期的进化过程中其实保守程度比较高，在同物种中基因本身序列的变化可能不是很大，更大的差异性在调控上。

11、研究两个抗寒性不同的品种，做蛋白质组学研究，我们应该分析哪些重要的途径来分析它们抗寒性差异机制，还有重要的蛋白maker？

答：首先，mRNA并不能直接反映蛋白质的表达。其次，蛋白质的功能受许多翻译后修饰机制的调控。第三，蛋白质的生成、活化、降解是一个动态的变化过程，最终活化蛋白的量不完全依赖于的水平。基因通过转录、表达产生一个蛋白质前体,在此基础上再进行加工、修饰，才成为一个具生物活性的蛋白质。而基因不能完全决定蛋白质后期加工、修饰以及转运定位的全过程。所以可以优先考虑寻找对蛋白起修饰作用的相关泛素化、磷酸化等蛋白在不同品种的差异，从而进行功能研究，解析抗寒机制。蛋白maker，没理解要表达什么意思。

12、低温处理转录组测序后，如何对大量数据进行筛选、确定低温相关基因进行深入研究？

答：低温处理转录组得到大量差异基因后，首先要看一些响应低温的Marker基因，如CBF等，验证自己转录组数据的可靠性，需要注意的是转录组时间点的选取不一样，基因表达也是不一样的。在这些差异基因中，选择一些未见报道的基因做功能验证实验才更有意义，这些基因的选取主要是依据基因注释和GO、KEGG注释来挑选一些自己感兴趣的基因，有些基因已被报道与低温相关，但是作用机制还不够清楚，可以选择这样的基因进行深入研究，或者想做一些其他信号通路与低温的交叉研究，也可以选取一些在低温转录组中有响应并且已被报道参与其他信号通路的基因。选取一些转录因子，功能验证可以考虑验证他的调控机制，如果选取一些酶，验证实验需要考虑这些酶是参与修饰或者合成降解底物，选取基因时自身的实验条件也应当考虑在内。

13、各位老师，你们好！我想问一下做盐处理，怎么处理更合理？用组培苗还是盆栽苗？如果用组培苗用液体培养基加盐，或者固体培养基加盐，还是半固体培养基加盐，哪种更合理一点？

答：组培苗作为植物的一种特定形态，因为没有根系，可能与正常植株产生的盐胁迫反应不同，同时同一植物的不同器官、组织和不同发育阶段对盐胁迫的响应也表现出较大差异。许多与盐胁迫相关的基因呈组成型表达或者在盐诱导条件下有很强的器官组织特异性表达。建议采用盆栽苗。如果用组培苗采用液体培养基加盐，或者固体培养基加盐，还是半固体培养基加盐，哪一个更合理些，这个不好做评价，如果必需要用组培苗做盐处理的话，建议可以使用组培苗生根后，进行水培盐处理。

14、请问用干旱和温度条件对材料进行处理的常规实验设计和取样注意事项？

答：关于干旱处理实验设计和取样注意事项：可以从以下几个方面考虑（具体实验还需要根据实验目的进行设计）。

干旱处理主要就是长期干旱和短期干旱，对于不同实验材料，不同实验目的采取不同的干旱处理方法。对于短期干旱处理（包括PEG模拟干旱）主要用于检测植物的应激反应，例如基因的响应表达或者激素含量等，许多基因的表达或激素属于快速响应，这就要求取样密集或者寻找一些mark基因作为参照，从而确定取样时间点。必要的生物学重复和技术重复都是必须的。                             

长期干旱处理主要表现植物对干旱胁迫的适应性，通过测定植物生理生态的响应，从各个方面真实的反应植物材料的耐旱性。首先，对样本生长（生物量）的影响，水分亏缺影响植物细胞的伸长及分裂，同时也影响水分在植物体内的重新分配（例如水分从老叶向幼叶的转移，老叶脱落），从根本上反应根系生长与环境因子之间的相互关系；第二，对根系活力的影响，体现在根的发育状况、吸收能力（水分、营养等）；第三，对光合作用的影响，干旱胁迫通过影响气孔的开张，叶绿素降解，以及各种酶的活性对光合作用产生影响；以及对其他代谢活动的影响。取样过程中，需保持取样时间，取样部位等保持一致（例如幼叶和老叶差异较大）。

对于其他的温度处理样品，实验设计、取样注意事项大同小异。以下几篇文献有关果树干旱和低温，会这个问题有所帮助。

doi: 10.1016/j.plaphy.2018.10.037.

doi: 10.1111/pbi.12794.

doi: 10.1104/pp.18.00502.

doi: 10.1111/nph.14952.

14、基因响应逆境胁迫（胁迫处理后，基因的表达变化了十几或更多倍），是不是就意味着改基因对植物的逆境胁迫有影响？还有就是在反向遗传学（从抗逆基因到抗逆性状），这个基因一般是怎么筛选的，有什么比较好的特殊点？

答：某些基因能够响应胁迫处理且表达量上调幅度较大，哪怕只是上调几倍，就可以说明该基因很可能参与植物胁迫响应过程。但这也只是一种可能，并不能直接反向推论改变该基因就一定能影响植物的抗逆性。要确认这种可能必须进行后续的验证。植物中很多基因在功能上具有冗余性，包括各种转录因子以及功能基因，其中少部分为逆境信号调控途径中较为关键的基因，单个基因表达量大幅度变化（如过表达或缺失）就能引起较为明显的表型差异，但其余大部分基因的单一变化，不一定显著影响植物的生长发育和抗逆性。例如拟南芥中bHLH转录因子bHLH010，bHLH089和bHLH091，三个基因的单一突变体在生长发育各方面都未表现出明显不同，只有同时突变时，才表现出与野生型的明显差异。

与抗逆相关的基因筛选方面，目前园艺植物研究仍主要是在模式植物研究的理论基础上，结合逆境处理和一些高通量测序及组学分析，筛选关键的抗逆基因。至于特殊点，与模式植物相比不同园艺作物有各自的特点，以我们研究的苹果为例，由于染色体较大且复杂，拟南芥中的一个基因可能对应苹果中多个基因，这种情况十分普遍，在多个研究中都有报道。另外，某些基因在不同的苹果品种中可能因为较小的碱基突变或者可变剪接等差异，从而导致完全不同甚至相反的表型，这也是园艺作物相对于模式植物研究的创新点之一。具体可以参考下列几篇文献

1. The DYT1-interacting proteins bHLH010, bHLH089 and bHLH091 are redundantly required for Arabidopsis anther development and transcriptome

Natural variation underlies differences in ETHYLENE RESPONSE FACTOR 17activity in fruit peel degreening

2. Apple fruit acidity is genetically diversified by natural variations in three hierarchical epistatic genes: MdSAUR37, MdPP2CH and MdALMTII

Natural variation in cytokinin maintenance improves salt tolerance in apple rootstocks

15、老师，我现在有个突变体材料，表型也能看到变化，我想做表观遗传学的研究，我应该从哪方面入手呢，换言之，想做表观遗传学研究，我需要什么基础呢？

答：首先，表观调控只是上游调控的一种方式，如果想从表观调控入手，分两个方向：1如果对表型有一定的研究基础，转录调控也做清楚了，可以考虑直接做调控基因，比如转录因子或者结构基因的表观修饰，如常见的甲基化修饰和组蛋白修饰。甲基化修饰检测方法在预提问里有答案。配合下游的转录调控，会加强新意。2如果没有什么线索，可以考虑从全基因组入手，但是一定要有下游的基因表达调控的研究，这样才能把表观调控落到具体的生物学问题上。我一直比较建议，遗传学调控做的差不多了，再从表观调控去解释上游调控机制是比较好的。表观调控也是基于遗传学基础上的。

16、在分析某个启动子甲基化程度时，可采用哪些方法，其中哪一种方法最实用，在测定过程中需要注意什么问题？有什么小技巧？

答：在分析启动子或者单基因的甲基化水平时，一般有三种方法：1. 重亚硫酸盐处理后测序；2. 甲基化免疫共沉淀后用qPCR检测；3. 甲基化敏感的酶切之后，比如McrBC，做PCR扩增。其中第一种方法，重亚硫酸盐测序的方法是最为常用，也是最被大家接受的一种方法，是甲基化检测的“黄金标准”，也应用在全基因组甲基化分析中。重亚硫酸盐测序的方法推荐使用试剂盒，进行DNA的处理，如Zymo的D5005，处理好DNA后，设计甲基化的简并引物，进行PCR扩增后sanger测序。整个实验的难点在于PCR扩增，因为DNA经重亚硫酸盐处理后，一是大部分没有甲基化的C转换成了T，序列结构变简单，同时存在polyT的结构，二是本身处理会对DNA产生损伤。因此，扩增长度不要超过600bp。另外，注意提取高质量的DNA进行处理，保证处理充分，减少假阳性，测序克隆越多越好，但是也没有一个固定标准，建议每个片段测序10-16个克隆。

17、请问有哪些胁迫因子可以产生类似低温（5-15摄氏度）的诱导效果呢？

答：从做实验的角度上来说，我们暂时没有发现有什么手段可以模拟低温。前面有人提问PEG模拟干旱的问题，我们也有提到，虽然这是一种比较常见的方案，但是PEG中难免存在对植物有毒的低聚分子，因此PEG模拟干旱通常也不会用于长期处理实验。至于低温胁迫，同样的道理，首先我们目前暂未发现有可替代的模拟手段，即使有，也难保会有附加伤害的存在。再者就是低温胁迫算是比较好操作的处理，特别是问题提到的5-15摄氏度，这个温度范围并不是很极端，有个比较好的植物气候箱或是有额外增加制冷压缩机的普通光照培养箱就可以实现。从逆境伤害的角度上来说，不同的逆境对植物产生的伤害是有其独特性的，比如干旱引起细胞脱水，膜结构变得不稳定，继而引发后续伤害；盐胁迫会对植物细胞造成过高渗透压力，并引起植物细胞内过高的离子浓度，引起离子毒害；低温会引起蛋白质活性降低，零点以下的温度会引起胞内产生冰晶，造成细胞破裂。当然，不同的逆境在对植物造成伤害的时候会有共同点，比如到后期可能大家都会引起细胞脱水了，都会引起活性氧爆发，但是第一阶段的感受与直接的伤害是有其独特性的。因此，从逆境伤害的角度上来说，我们也不建议用其它的胁迫因子去模拟低温，还是直接做个低温处理比较好。

18、在桃、猕猴桃、芒果、黄瓜、青椒等果蔬低温贮藏时会出现木质化、褐变、水渍状等冷害现象，特别是在一定的低温范围内，冷害症状明显加剧，比如桃在4-6摄氏度贮藏30左右即出现冷害，是什么原因或什么物质造成了冷害的发生？

答：冷害一般认为温度不适宜植物生长发育但又不足以形成冰冻。园艺果品在低温贮藏过程中经常会遭受冷害，导致褐变、水渍状等现象，这些现象其实与高温类似，都是影响了细胞膜的稳定性，冷害是降低了细胞膜的流动性。低温下，膜脂流动性变缓，内部所包含的蛋白质就不能正常地行驶功能。其结果抑制了许多生化反应，包括H+泵ATP酶活性、溶质细胞内外转运、能量传导及酶依赖的代谢反应，导致冷害的发生。

19、如果抗旱胁迫的转录组数据表明，与某种物质相关的基因上调和下调的基因只有几个，是否就说明这物质在抗旱方便的作用就不大？

答：这个要看具体情况，首先这种物质是否在干旱中有重要作用，需要额外验证，不能仅凭转录组的基因表达变化去判定。

关于干旱影响物质的基因表达，可以参考GO或者KEGG分析的方法，看是否在这个物质代谢途径中有富集。另外，上调或者下调的基因是否为该物质合成的关键基因，如果上下调基因在物质合成中有重要角色，可以考虑深入研究。

20、请问各位老师有做过由钙不足引起的果蔬生理性病害的研究吗？这个从机理上研究  应该从哪里着手？从分子层面怎么分析？

答：钙离子有很多功能，果实上生理病害如水心病、苦痘病、虎皮病等都是由于果实中钙离子不足导致的，我认为，钙离子作为细胞内的第二信使，在信号转导方面具有重要作用，而生理病害的产生很大一部分是由于氧化胁迫导致的，钙离子信号在细胞内的识别转导需要集中钙离子感受器，这些感受器结合钙离子后对下游一些基因进行互作、修饰等激活或失活下游蛋白的功能从而调控细胞内氧化还原过程，从而缓解果实生理病害的发生。你可以用外源钙离子和EGTA处理入手，一种是丛外源补充钙离子，一种是钙离子螯合剂，可以螯合细胞内钙离子导致钙离子不能被感受器结合，这两个处理后可以看一下内源钙离子感受器的变化的种类，从而确定钙离子参与了那些途径，随后在深入了解具体机制。

21、如果已经有了胁迫处理后的转录组数据，有没有比较好的方法挑选一些逆境胁迫下的关键基因？  

答：如果只用一个品种做转录组，那就挑表达上调、下调变化比较大；如果是两个表型差异大的种，则除了考虑品种内转录水平差异大之外，还要考虑表型差异，如不同品种间表达模式不同。至于挑什么基因，则看个人擅长什么。如果擅长转录因子，则挑转录因子。转录因子也是比较好做的一类。如果擅长蛋白质修饰，那就挑相应的修饰类基因。或者表观遗传相关的。不同基因会有不同机制，也会有不同故事。

22、比较两个品种的抗寒性，做低温驯化处理，我们分析了花青素途径，其中抗寒性较高的品种，这个途径表达量相对较高，我们应该如何联系他们的抗寒性差异机制？

答：花青素原本就在植物抗寒中有重要贡献，下一步分析差异的物质的具体变化，以及催化合成相应代谢物的酶在冷胁迫中的表达变化即可将代谢数据与抗寒性联系起来。

23、在做梯度干旱胁迫后，植物表型有变化，呈现梯度萎蔫，随后对生理参数，特征化合物进行测量和分析，发现并没有表现出梯度变化一般这种情况应该怎么办？

答：干旱胁迫下生理参数的变化总是早于表型的变化，应当在观察到表型之前就开始对植物的生理生化指标进行采样测量。

24、请问在非生物胁迫处理下，表达量非常高的转录因子，是否意味着其在该胁迫中的功能核心地位？

答：表达量高的转录因子未必是核心地位，也有一些表达量在短时间升高后降低的转录因子在非生物胁迫中起到关键作用，因为转录因子更像是一个阀门，一些低丰度的转录因子也可以激活下游基因大量表达。当然表达量很高的转录因子是我们做研究时首先关注的基因。

25、在做梯度干旱胁迫后，测到的生理参数，特征化合物并没有表现出梯度变化一般这种情况应该怎么办？      

答：植物体的基因表达，各种酶活以及其他指标对干旱的响应是要远远的早于植物表型的。通常目测到植物表型的时候，基因及生理参数的变化已经不能代表当前植物的状态。建议在实验过程中多增设采样点，选取适当的时间点分析数据。

26、我通过蛋白质组学，发现两个抗寒性不同的品种 在光合作用通路 特别是天线蛋白的有很大差别的表达情况，这个知识点有什么可以继续深挖的吗，如何与抗寒性机制联系？

答：这个取决于你做的植物。我们做的苹果抗寒中叶片是没有意义的，因为对于苹果来说冷害发生时叶片早就没有了。如果你做的是常绿植物或者拟南芥，那么可以继续思考。冷害下膜系统流动性受损带来的离子渗漏可能会导致相应的光合系统受损，但是这需要进一步的思考。

27、在实验室中，进行植物干旱实验时，同一批植物自然干旱时，自身群体差异性较大，有的干死了有的活的好好的(种子来源一致)，总感觉是土壤当中水量不一致导致的，请问老师们，如何避免干旱性实验中的误差？

答：或许有。光和系统在干旱下由于气孔关闭，CO2供应不足，会有比较严重的电子传递-碳同化解耦联情况，这种情况发生时，过量的还原力会导致植物体内氧化还原平衡失衡，进而带来膜损伤等一系列后续影响。相关文献比较容易查阅，drought carbon failure 相关的综述。

28、请问盐胁迫对植物材料进行处理的常规实验设计有哪些注意事项？

答：盐胁迫处理时需要注意盐浓度的选择，如果浓度过高可能会发生shock，导致植株快速死亡，一般苹果采用200mM氯化钠处理，如果是将盐溶液浇灌土壤中时应注意，应根据情况频繁浇灌盐溶液，每次要将盐溶液浇灌至从盆底部流出，保证之前的盐溶液被冲出，还有就是采样问题，像苹果，一般要采成熟叶片，时间也要掌握好，如果你要研究转录因子，可能需要取样点提前一些。

29、CBF转录因子在低温中起到重要的作用，低温转录水平有高水平的表达，可是我在经过14天低温驯化的蛋白质组学的数据里，没有鉴定到cbf蛋白，请问老师这是为什么?

答：CBF一般在低温处理3-6小时达到高峰，12小时开始下降。

30、老师你好，我想问下一个转录因子是负调控因子，但其过表达植株却可以提高抗冷性，请问这个合理吗？

答：首先，这个负调控因子，指的是负调控低温抗性么？如果是直接指负调控低温抗性的，那应该是有问题的，除非是出现过表达导致基因沉默的现象，这种情况是有过一些报道的。如果是指负调控一些低温关键基因或者转录因子，那么这要看具体情况。另外，模式植物中的研究结果，在其他物种中的同源基因不一定是完全保守的，功能发生变化甚至相反也是有过报道的。

32、非生物胁迫和甲基化以及基因表达的相关性怎样验证？怎样验证是非生物胁迫导致的基因表达改变和甲基化还是植物基因表达的改变、甲基化是为了响应非生物胁迫？

答：首先，甲基化和基因表达的相关性，从最新的全基因组甲基化研究看，没有必然的正或负相关，而且启动子区域的甲基化和基因区的甲基化存在不同的机制。最新的甲基化综述提过，甲基化影响基因表达并不是简单的负相关，甲基化既可以激活基因表达，也可以抑制基因表达，一般认为启动子甲基化抑制基因表达的多，基因区的甲基化对表达影响不多，但功能未知。所以要根据具体的位点去检查，该区域在生物学过程中甲基化的变化和表达的变化，再做联系。一般认为甲基化诱导了表达的变化。更多细节可以看看2018年朱健康老师发表的综述dynamics and function of DNA methylation in plants。但是，如果要验证某个位点的甲基化和表达关系，直接做甲基化水平检测和表达，但是不要坚定的认为一定是负相关，有甲基化激活表达的报道。

第二个问题描述不清，非生物胁迫下，肯定会引发一系列的基因表达和甲基化的改变去响应和适应逆境，并且有些表观修饰位点还可以遗传到下一代。

33、干旱胁迫的植物与未胁迫的植物相比，发现花青素的上上游基因表达严重上调，那么在该基因功能验证时，除了验证该基因调控花青素代谢之外，是否还需要转基因验证过表达该基因的植物比没有过表达的更耐旱？

答：首先这个上上游基因对花青代谢的调控肯定是要验证的。进行转基因验证该基因耐旱也是非常有必要的。特别是现在的研究中，都更倾向于用本体植物来做转基因验证，可以最大程度上还原该类植物在抗旱中的应答机制。在进行转基因验证的时候，建议过表达和干涉的同时进行，这样可以正、反面解释问题。有一点要注意的是，如果这个上上游基因仅限于调控花青素代谢，那么花青素可以作为唯一的下游被验证的物质；如果这个上上游基因是个转录因子类的基因，它的下游可能不仅限于花青素这条途径。在验证它的抗旱的时候，可能还需要寻找更有价值的下游途径。

34、南方梨树早起落叶非常严重，导致落叶的主要病害是由真菌病害炭疽病引起的。目前，我主要是利用生物有机肥结合腐植酸灌根来促进根系构型的变化，增强梨树树体营养，提高其系统免疫抗性，以期减轻梨树早期落叶的发生。除了研究根系构型外，该如何跟地上部结合起来？我该关注哪些重要的参数？

答：您课题组也是利用施肥改变根系结构进而提高梨树体抗性，我认为除了关注根系结构变化外，还应关注根系菌落变化以及菌落变化产生的小RNA的变化对地上部的影响，有研究报道过，根部菌群变化通过改变根系小RNA的组成影响整个植株的抗性，不管是非生物抗性还是生物抗性，都会影响，如果想寻找相关的机制，可以测根际微生物组学以及小RNA组学研究，分析到底何种根际微生物和小RNA变化导致树体抗性增强。

35、褪黑素调控非生物胁迫中有没有关键的转录因子，或者较为关键的转录因子参与其中？

答：过表达热激转录因子HsfA1a的番茄转基因植株在Cd胁迫下能够促进褪黑素的积累，并且HsfA1a能够结合到褪黑素生物合成基因咖啡酸O-甲基转移酶1（COMT1）的启动子上，促进其表达，进而促进其Cd耐受性。

还有在木薯中MeWRKY20和MeWRKY75转录因子能够与褪黑素合成酶基因MeTDC2、MeASMT2和MeASMT 3相互作用形成复合体，诱导MeTDC2、MeASMT2和MeASMT 3的表达对内源性褪黑素的水平造成影响。

详见以下参考文献

https://doi.org/10.1111/jpi.12487

https://doi.org/10.1111/jpi.12387

36、盆栽植物盐胁迫处理建议初期通过1-2次盐水浇透的方式将浓度控制，后面少量补水，避免盐分渗出。但如果是沙培（石英砂粗粒）的话，是不是每次都要浇灌盐溶液，那浇灌频率多少为好（1天1次还是1天多次）呢？

答：要尽量用细沙。浇灌频率取决于水分状况。沙培还是建议每次浇灌盐溶液，但一定要浇灌到漏水，让盐溶液漏出，避免盐累积。

37、（1）用PEG-6000短期的实验处理，大概用多大浓度处理，因为太高浓度的PEG会造成培养基的不凝，您们是如何解决的？（2）请问如果对苹果苗或者愈伤进行低温或者高温胁迫您建议多少℃？（3）请问你们用多大浓度的ABA和PEG-6000处理苹果组培苗和愈伤比较好？（4）如果想要对组培苗做为期7天的干旱胁迫，除了PEG-6000以外还有别的推荐吗？         

答：（1）关于PEG的处理浓度，要根据不同浓度PEG可以引起多大的水势决定。具体细节请参考Methods and concepts in quantifying resistance to drought, salt and freezing, abiotic stresses that affect plant water status。PEG并不适合直接与培养基混合。高温灭菌时，PEG会分解失效。我们用水培植物做PEG处理，时间不超过12小时。（2）低温处理检测基因表达用的是4℃，高温45℃。（3）ABA处理用了100μM。 （4）组培苗并不适用与做为期7天的干旱模拟，建议用有根的，生长在土里的植物做。

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