【应用攻略】使用Molecular Devices 最新发布SoftMax Pro 7软件 进行平行线分析和相对活性评价

介绍

在生物实验中要经常要使用到的平行线分析（PLA）方法，当无法直接检测一个生物制品的活性而只能通过检测其产生的效果时，PLA方法通常会被用来进行效应曲线的比较来获得此制品的效果（Figure1）。如果对于两种物质其生物响应相似或者在两种不同的生物环境中同一种物质产生相似的效应曲线时，平行线分析法可以被用来进行评价。评价平行性是计算化合物或药物相对活性的前提，并且在很多生物应用中如药物活性比较、分析物鉴定、交叉反应、干扰物质、基质补偿、浓度估算和抑制效应等应用研究中。

当两条曲线被判定为平行时，其中一条曲线的函数可以通过通过另一条曲线的函数乘上一个比例系数向X轴的左边或右边变换获得：ƒ(x) = ƒ(rx), 其中x是剂量，r是比例系数或相对活性。对于相对活性，一般将参考品（已知品）的活性设为1，可以使用一个比例系数可以将参考品的曲线变换为测试品（未知品）曲线，那么这比例系数则被称之为测试品的相对活性。这个方法应用于线性拟合的曲线非常合适，因为线性拟合的曲线在整个浓度范围内的曲线斜率是保持一致的（Figure2）。可是对于非线性拟合曲线如4-参数和5-参数曲线，S形的浓度效应曲线在整个测试浓度范围内具有变话的斜率值（Figure1）。

用于评价平行性的方法根据平行性假设的验证方法不同大致可以分为两大类：效应比较法和参数比较法。本文将对这两大类方法进行详细解释和介绍怎样使用SoftMax® Pro 7软件进行平行性测试。我们建立了一个Protocol包括了使用F-检验进行F-检验概率测试和使用卡芳-检验进行卡芳概率测试。另外，对于参数比较法，根据菲勒定理我们也建立了一个Parallelism Test 的protocol放在SoftMax Pro Protocol的库内。所有这些方法都可以被用于评价线性和非线性拟合曲线。

Figure 1. 使用约束型通用4参数曲线拟合进行效应曲线的平行线分析。

Figure 2. 线性回归平行线模型。参考曲线的相对活性（红色圈）设为1，用来变换参考曲线为测试曲线（蓝色圈）使用的校正因子即是未知品的相对活性。

平行性检测

效应比较法

生物系统经常会出现不符合预期的现象，并且数据会出现一些噪声和波动；因此，选择正确的曲线拟合方式和权重因子，来消除这些噪声和波动是进行平行性评价前的首要一步。如果选择了一个不合适的拟合方式，那么可能在平行性评价系统内引入偏差，进而得出错误的结论。

由于根据实际实验中的数据，很难获得完全平行的拟合曲线，尤其对于非线性拟合回归，而计算非平行曲线获得相对活性是很困难的。在效应比较法中，参考品和测试品的曲线会使用约束模型同时进行拟合，在这个模型中，曲线被强制变为平行；而在非约束模型中，两条曲线会各自进行拟合。通过统计学的方法，来比较约束模型和非约束模型两种拟合度的差异，这个差异可能是由于非平行性造成的。

在约束模型中，用来描述曲线的所有参数都是一样的，除了用来描述X-值的参数不一样；线性拟合中，X-值是指截距，非线性拟合中是指上、下渐近线之间的中值，也就是EC50值。SoftMax Pro软件具有计算线性拟合的相对活性，也可以使用约束性模型（全局拟合模型）和独立模型对非线性拟合曲线进行评价和计算相对活性。

虚假设测试

在效应比较法中，平行性的计算通常是利用残差平方和（RSSE）的函数来进行的,以此来判断约束性模型对数据的拟合效果，另外一个特殊的方法，则是根据附加平方和的分析来进行。这个统计学回归方法是方差分析(ANOVA)的一种形式，其中虚假设的是约束性模型是正确的或者说曲线是相互平行的。虚假设的验证，可以使用各种不同的统计学技术，包括概率的F-检验或卡方检验。在这两种方法中，概率值会被计算出来，通常这个值介于0-1之间，当这个值接近1时，意味着曲线间的平行性在增大。需要注意的是，F-检验是有一定缺陷的，此法对于对独立模型拟合度很高的曲线可能产生假阳性判断或者对于独立模型拟合度很低的曲线产生假阴性的判断。这两种方法都被收录进了SoftMax Pro软件当中，检验值和概率值计算可以通过软件内的以下公式方便的获得：

• ChiSquaredPLA (PlotName@GraphName): Returns the value of the chi-squared statistic for a reduced curve fit. 返回被拟合曲线的卡芳统计值

• ChiProbabilityPLA (PlotName@GraphSection): Returns the chi-squared probability distribution value for a reduced curve fit.返回被拟合曲线的卡芳统计值概率分布值

• FStatPLA(PlotName@GraphSection): Returns the value of the F-test statistic for a reduced curve fit.

返回被拟合曲线的F-检验值

• FProbPLA(PlotName@GraphSection): Returns the value of the F-test probability for a reduced curve fit.

返回被拟合曲线的F-检验值概率分布值

注：以上所有公式只有在曲线拟合选项设置中的Global Fit (PLA)选项被使用的情况下才可以使用。PlotName@GraphName是曲线的全称，包含图表的名称，例如，Plot#1@Graph#1或Std@Standardcurve。指定某一条曲线作为公式内曲线是带有主观性的，实际上卡方值是从该图表中的所有曲线数据计算而来的。

名称为“Parallel Line Analysis Using F-test and Chi-squared Test”的模板，是根据这两种统计学方法而建立的SMP模板。当使用仪器直接获取到数据或者从外部导入数据到模板中后，所有的计算过程会自动进行，并进行零假设的评估，判断曲线是否平行。

在这个模板中，F-检验和卡芳检验的概率值必须大于等于0.95才能认定曲线是平行的。一般来说，这个设置的意思是指有95%的置信度该假设是成立的。置信程度是可以被调整的以适应不同实验的接受水平。

噪声和权重

噪声是指检测响应的随机变化，当进行平行线评价时这是需要考虑的重要因素，因为它会影响检测平行性的能力。在高噪声的情况下，平行性计算值由于由于受噪声的影响过大，因此无法再正确的反应非平行性的程度。

对于F-检验和卡方检验法这两种方法，在计算各自的概率值的过程中对于不同噪声水平的处理能力是不同的。F-检验的概率值不受此因素影响，但是卡芳检验概率计算值则高度依赖于噪声水平并要求对于数据方差进行准确的估算。因此，对于卡方检验法需要进行反方差权重设置。

如在“Selecting the best weighting factor in SoftMax Pro 7”此篇应用资料里讨论的，生物实验一般在在曲线的上半部分会有较大的方差。在无权重的回归分析中，平行性的结果会主要受曲线的上半部分的数据点影响，而曲线的下半部分的数据点在对于平行性结果的影响不大。

在软件的模板中，权重因子的设置使用方差的倒数，但是根据情况可以调整为更合适的权重公式。另外，在SoftMax Pro 6.5或更高版本中，可以直接进行方差的倒数权重项的设置(Figure 4G)。卡方检验方法中，参数的置信区间设置项(Figure 4H)只有在‘Weights are Inverse Variances’项被选择的情况下才能使用。最佳的权重因子的设置会保证结果是主要来源于所有变化的数据点。

如何在SoftMax Pro使用PLA

在SoftMax Pro 7软件中，PLA可以在除了“point-to-point“, ”log-logit“ 和 ”cubic spline“三种拟合方式之外的所有通用曲线拟合方式下使用。在图表部分，所有曲线具有一个共同的曲线拟合方程，PLA的具体使用设置请见Figure 4。

参数比较法

与响应比较法直接评价不同剂量曲线下的响应差异不同，参数比较法会各自独立地对非约束模型下的各个曲线的参数进行比较，并参考大概置信区间；参数对必须落在规定置信水平下的置信区间内。这种方法叫做等效测试和平行性小于规定阈值的测试法。欧洲药典中使用的斜率比值法就是等效测试法的一个例子。

菲勒定理

菲勒定理使用统计学方法计算两个参数比值的置信区间，使用tInv 函数进行比值的计算，因此遵循带自由度的t-分布，其概率为p。SoftMax Pro软件的统计学公式，可以计算参考曲线和测试曲线各自曲线拟合参数之间比值的置信区间，并建立了一个模板(Figure 5)包含了这些计算和概率阈值设定0.1（90%置信度），可做相应调整。为了判定参考曲线和测试曲线之间是否平行，需要将计算的置信区间与一定置信水平的固定置信区间进行比较；在此模板中，使用90%的置信水平，因此，计算的置信区间如果落在0.9~1.1之间，那么这两曲线将被认定为平行。

对于线性拟合曲线，该测试会针对参考曲线和测试曲线的斜率值进行，也即SoftMax Pro软件中所描述的曲线方程内的B参数值。可是，对于非线性拟合曲线，此方法只测试上平台和斜率值，下平台则由于菲勒定理的数学局限而不做测试。在低浓度时，参数的变异会非常高，导致中间计算过程会产生虚数，进而导致最终计算的置信区间不正确或无法计算。这个问题被美国农业部（USDA）的兽用生物制品中心建议将下平台值固定为0，然后使用上平台和斜率值来进行测试。相同地，SoftMax Pro 软件的Parallelism Test的模板内，默认将下平台值设为0，然后对斜率（参数B）和作为上平台的参数A或D进行平行性结论的判断。

Figure 3. 非线性回归的平行线模型。相对活性的计算由曲线的线性区段的半效剂量效应EC50获得，曲线使用约束性模型进行拟合，除了描述X-轴的参数外，各条曲线的4参数方程中的各个参数都是相同的。

Figure 4.如何在SoftMax Pro软件中应用PLA和进行相对活性计算。选择一个包含多个曲线的图表，

Figure 5. 在SoftMax Pro 7软件中使用效应比较法进行平行性评价。初始的置信水平和概率分别设置为90%和0.1，但是可以根据情况做相应调整。当在此置信区间内参数比值的低值（rBCILower和rDCILower）和高值(rBCIUpper 和 rDCIUpper)分别被计算出来后，会被拿来与定义的置信区间标准值(lval 和 uval)进行比较，如果计算出来的置信区间值坐落在定义的置信区间范围内，则认为参考曲线和测试曲线是相互平行的关系。

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