【领读】《Nature Biotechnology》：成人肾脏和尿液中提取的细胞诱导类肾小管用于个性化疾病研究

类器官来自多能干细胞或分离的器官祖细胞，它们分化形成具有多种细胞类型的类器官组织，并能自己形成类似于体内器官的结构。这项技术建立在干细胞技术、经典发育生物学和细胞混合实验的基础上。这些研究阐明了器官发生过程中结构组织中的两个关键事件:细胞分类和空间受限的定向谱系。这两个过程都在类器官中被再现，类器官可以自我分化形成器官本身的细胞组织并建立连接。

到目前为止,人类的多能干细胞已经诱导产生肠、肾、脑，和视网膜等器官。这些复杂的结构提供了一个模拟人器官的独特机会，在一个与体内发育非常相似的系统中进行培养，使得类器官能被应用于人类特有的生物学问题。

类器官的治疗前景可能是最有潜力的领域，这些独特的组织有可能成为发育性疾病、退行性疾病和癌症的研究模型。

图1：类器官生成和治疗潜力。从人类多能干细胞（PSCs）中可以得到许多器官的类器官。与体内的器官发生类似，类器官通过细胞的分选和前体细胞的空间限制性谱系定向。类器官可通过引入疾病突变或使用病人来源的 PSCs 来建模疾病。未来的应用可能包括药物测试，甚至组织替代疗法。

本文构建了具有肾小管功能的类器官模型，并对该模型以个性化的方式应用于感染性、恶性和遗传性肾病的模型的验证。

然后从囊性纤维化患者的尿液中提取细胞进行类肾小管的诱导，进行体外的治疗效果评估，以检验该模型的可行性与便利性。

最后，在微流控芯片上的 3D 器官培养的微管结构呈管状构象，表明类肾小管具有有活性（反式）的上皮转运功能。

图2：

a.基底免疫荧光染色 ɑ6、ZO1 和 F-Actin 表明类器官形成了具有极化的上皮；

b.基底外侧角蛋白联合根尖乙酰化小管蛋白（原纤毛）和 F-Actin 的免疫荧光染色证实了小管的极化性质

c.免疫荧光法结合基底外侧 Claudin-3 和 F-Actin 染色检测近端小管微绒毛标记物绒毛蛋白的表达

g/h. 免疫荧光检测收集管标记基因的存在:主细胞标记 AQP3 （n=3 个独立实验）（g）和插入细胞标记 SLC4A1（n=3 个独立实验）（h）

i. 联合表达GATA3和CDH1证实存在收集导管细胞（n=3个独立实验）。

j. 在无生长因子条件下观察远端小管标记物 CALB1 的表达（n=2 个独立实验）。

k. 少数小管样细胞表达 Henle 环标记物 SLC12A1 （n=2 个独立实验）。

为了评估近端小管细胞的功能，我们将小管暴露于近端小管外源生物泵 ABCB1 （p- 糖蛋白（P-gp））的底物（calcein-AM，它自由地扩散到细胞中）中，同时加入或加入 P-gp特异性抑制剂 PSC-833. 如果 P-gp 在小管中起作用，当 P-gp 活性被阻断时，Calcein-AM（在细胞内会分裂成荧光钙素）就会发生积累并发出荧光。

图3：

l. 小管显示近端小管转运体功能:通过添加 p-gp 特异性抑制剂（+ P-gp-i），可以观察到荧光钙素（Calc）的积累。如果没有抑制剂（- P-gp-i），就不能观察到这种现象（n=3 个独立实验）。

BK 病毒是一种小管特异性环状 DNA 病毒，目前尚无治疗方法。为了验证肾小管可作为研究 BK 病毒感染的体外模型，我们用临床分离的原代细胞系中繁殖的 BK 病毒感染肾小管。

为了检测培养物中产生的病毒颗粒是否具有感染性，我们在试管感染后 30 d 对培养物上清进行了过滤。当培养基被清洗第 13 次时，具有感染力的病毒颗粒最少。滤过的上清液孵育小管也足以建立感染，随后的培养中病毒拷贝数明显增加，表明感染性病毒颗粒的活力产生。

因此，类肾小管可被用于 BK 病毒感染模仿临床组织病理学的斑片状感染模型和组织学研究，并允许在体外测试治疗效果。

图4：

a. 周期性酸-希夫染色显示大的蓝色细胞核（核内嗜碱性病毒包涵体;箭头）在感染后 10 d 的小管状体中（n=2 个独立实验）。

b. 较大的细胞核（箭头）在感染后第 10 天呈片状，SV40 T 抗原染色（n=2 个独立实验）。

c. 此外，感染后 10 天染色，在同样的小管状核中也存在 VP-1 。

d. 透射电镜显示感染细胞 10 天后细胞核内存在病毒颗粒，阴性对照无病毒颗粒。

e. BK 病毒颗粒在培养的前 10 天呈指数增长（每一行代表一个独立的实验，数据以每毫升国际单位表示基因组当量）。

f. 直接从 BK 病毒肾病患者尿液细胞诱导建立类器官：病毒颗粒的数量在孵育开始到培养 10 天后急剧增加

g. 感染 BK 病毒的滤过性小管上清具有感染性：对比孵育前和 10 天后的培养基每个点代表一个独立的实验（n=2）。

h. 在 CDV 存在的情况下，BK 病毒拷贝数呈剂量依赖性显著减少。

图5：

a. 患者1 （Pt1）的肾母细胞瘤来源的肿瘤样物，通过明场显微镜（至少有 3 个独立实验的代表性图像）观察，显示肿瘤基质（箭头）腔室扩张。

b/c. 原发性肿瘤组织（b）和肿瘤样系（c）的苏木精染色（H&E）和伊红染色（H&E 染色一次）均显示典型的三期肾母细胞瘤组织学特征，其中有囊胚（箭头 b）、上皮（箭头 e）和基质（箭头 s）。

d/e. 第 2 例肾母细胞瘤（Pt2）未见三相形态：明场（至少 n=3 个独立实验的代表性图像）（d）和 H&E 染色（e）。

利用先前描述的方法，我们能够从尿液中分离出细胞，用这些细胞构建肾小管类器官。

图6：

a. 尿源性小管可以起源于肾上皮细胞，如所示 PAX8+ 染色（n=4 独立实验）。

b. 偶尔也观察到尿路上皮细胞（P63+ PAX8 -）衍生的类器官存在（ n=4 独立实验; P63 + PAX8 - 细胞呈单行分布）。

通过 3D 培养技术，在微流控芯片培养板上培养的肾小管衍生细胞可以形成无泄漏、极化的肾小管，并能够在芯片上以器官形式表征（跨上皮）转运蛋白活性，进而能在该类肾小管中进行个性化转运蛋白和药物研究。

图7：

a. 在标准 384 孔微滴定板中嵌入 40 个微流体细胞培养芯片的有机平台。芯片上的一个芯片的结构示意图，芯片上的器官有单独的凝胶室，细胞在一个培养基通道中灌注（A''）。

b. 接种后 7 天，通过明场显微镜观察形成融合管状层（ n≥3 个独立实验，每个实验最多 40 根管）。

c/d. 免疫荧光显示细胞表达 ZO1,紧密连接的一个标记位于近顶端（n=3 代表独立实验至少有 3 个重复）（c）和钙粘蛋白（背景）,一个标记为黏附连接（n=3 代表独立实验至少有 3 个重复）（d）。

e. 免疫荧光显示细胞乙酰化微管蛋白阳性细胞的顶面和Na+ / K+ ATP 酶基底外侧,显示细胞极化（n=3 个独立实验的代表性图像，至少有 3 个重复）。

f. 免疫荧光显示 Ezrin 阳性细胞，Ezrin 是近端小管细胞顶端微绒毛的标记物（n=3 个独立实验的代表性图像，至少有 3 个重复）。

在这项研究中，建立了一个类肾小管培养系统，能够长期增殖和分析健康或患病的人体肾组织。诱导的类肾小管保留了原代肾上皮细胞的功能特征，代表不同的肾单元，最明显的是近端小管。

首先，试管培养物是异质的。在某种程度上，这是该系统的一个优势，因为管状细胞的异质性可能反映了管状上皮内的异质性。缓解异质性的一种策略是创建代表区域特性的克隆株系。对于某一些研究，这将是有益的（例如，研究一种特定的近端小管转运体），而对于另一些研究，这将是一个缺点（例如，研究肾肿瘤异质性）。

虽然我们能够生成表达不同肾元室标记物的细胞，但近端小管细胞生成的条件是有偏差的。未来的研究将加入生长因子条件，用以产生肾单元的其他部分。

综合目前的研究结果，我们已经建立了一个多用途的原发性肾上皮细胞培养系统，可以快速、个性化地进行分子和细胞分析、疾病建模和药物筛选。未来的研究可能会优化特定的生长因子（缺乏）条件，以丰富 Henle 环和远端小管细胞类型。 

本文中，器官芯片实验均由 Molecular Devices 的 ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高内涵成像系统进行的拍摄和分析。