荧光检测中的 HTRF 技术到底是什么？

荧光反应是指一种光致发光的现象。通俗来讲，就是当某一物质被某一波长的光照射后，产生发光现象。

通常，在分子生物学领域，使用具有荧光功能的酶标仪经常用来进行相关实验。

在荧光检测时，激发波长和发射波长间的差异能够基本解决使用吸收光法进行检测时存在的杂色光的影响，同时 Molecular Devices 的多款酶标仪中也会使用相关的专利技术，调整激发和发射的光路，使两条光路的路径分开，更好地消除了激发光的杂散光产生的影响。

但由于激发光的杂散光是固定且无法完全消减的，当荧光物质量极少时，杂散光的影响就会显得更为严重，或有些实验希望得到更真实的样品结果，这时，我们可以考虑使用其他优化后的检测方法。

时间分辨荧光分析法（Time resolved fluoroimmunoassay, TRF）是近十年发展起来的非同位素免疫分析技术，其灵敏度高达 10^(-12) g/ml。普通荧光的半衰期为纳秒级，而稀土元素中的镧系元素半衰期为毫秒级，这种方法正是利用了这几乎 6 个数量级的差距，将检测窗口延迟——此时，背景信号几乎为零，而待测样品信号仍然有较高的荧光强度。

所以，使用时间分辨荧光的方法，背景信号将会变得非常低，更有利于检测样品的实际情况。

另有一种在荧光检测中常用的技术手段为荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）技术：当一个荧光分子（又称为供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（又称为受体分子） 的激发光谱相重叠时， 供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光， 同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。

如果说荧光是“光致发光”，那么荧光共振能量转移则是“光致光致发光”在线套娃。

这种技术通过两次激发和发射，将整个实验过程中的激发光和发射光的波长差距拉到更大，通过另一种方式降低了杂散光的影响，提高了信号的准确性。

而均像时间分辨荧光（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence，HTRF）技术则是“站在两个巨人的肩膀上”，利用荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）技术与和时间分辨荧光技术相结合，提供了更高的灵敏度和稳定性。

Cisbio 公司开发的 HTRF 技术结合了荧光共振能量转移和时间分辨荧光技术 ，采用铕（Eu）的穴状化合物作为供体荧光基团和一种经过修饰的别藻蓝蛋白（XL665）或小分子 d2 作为受体荧光基团。当标记了铕穴状化合物和 d2 的生物分子相互作用时，FRET 就会在供体和受体荧光基团间发生，可在 665 nm 处检测到荧光发射，此时大部分穴状化合物的激发能量都以 620 nm 荧光发射释放出来。

铕穴状化合物的结构。由于在该结构上的贡献，Prof. J.M.Lehn’s 在 1987 年获得了诺贝尔奖。

这种方法结合了两种荧光检测的优势，既可以拉大激发光和发射光之间的差距，又可以在大部分背景信号湮灭后再进行检测，可以将背景影响降至极低，提高实验结果的可靠性。

下面我们将通过一个实验来进一步了解一下 HTRF 技术。

HTRF 技术非常适合监测细胞因子和趋化因子在细胞实验中的释放，特别是像外周血单个核细胞 (PBMC) 这样的物理模型。所以，本次我们使用 Cisbio 公司提供的细胞因子和趋化因子定量的均相时间分辨荧光 (HTRF) 检测试剂盒，来检测细胞因子与细胞活性变化的关系。

通常，细胞因子释放的调节依赖于使用药物化合物来诱导或抑制它们的分泌。分析它们的作用，特别是对细胞活力的影响，可以进一步了解这些药物的作用机制。

我们使用 SpectraMax i3x 多功能微孔板读板机和 SpectraMax Minimax 300 细胞成像仪如何对细胞因子分泌和细胞活性进行分析。该方法可以逐孔/逐细胞进行 HTRF 和细胞活性检测，并通过细胞形态来确定其质量。

解冻冻存人类 PBMC，并将其以 50,000 和100,000 细胞/孔接种于底透黑色的 96 孔板中，每孔接种 200 µl RPMI + 10% 胚牛血清（FCS）。在细胞处理前，用 MiniMax 细胞成像仪透射光检测 PBMC 接种量。

为了调节 IL6, IL8, TNFα 和 IL1β 分泌，PBMC 处理 16 小时，地塞米松浓度递增，一个已知的糖皮质激素会抑制促炎细胞因子分泌，再加入 0.2 μg/mL LPS 诱导细胞因子分泌。为了调节 IL2 和 IFNγ 分泌，PBMC 处理 16 小时，地塞米松浓度递增，再加入 0.5 ng/mL PMA 和 1 μg/mL 离子毒素。

过夜培养后，每孔上清 16 µl 转移至小体积384 孔板 (Greiner #784075) 进行 HTRF 细胞因子分析。每个样品用1∶10/1∶20 比例稀释，这样每个分析都在其线性范围内。

细胞因子浓度根据对应的标准曲线计算，RPMI + 10% FCS 稀释成标准品（HTRF 细胞因子试剂盒：62HIFNGPEG, 62HIL02PEG, 62HIL1BPEG, 62HIL06PEG, 62HIL08PEG, 62HTNFAPEG）采用 SoftMax Pro 软件中预设的模板在 SpectraMax i3x 微孔板读板机上进行 HTRF 细胞因子分析。

采用 EarlyTox 细胞完整性检测试剂盒对细胞上清进行细胞活性的评估。EarlyTox 细胞完整性检测试剂盒 (Molecular Devices, P/N:R8213) 有 2 个 DNA 结合染料：活细胞红色染料 ( 标记所有细胞的细胞核 ) 和死细胞绿色染料 ( 只标记死细胞 ) 。

细胞活性用两种颜色的荧光染料在 MiniMax 细胞成像仪上成像 ( 绿色：460 nm 激发/541 nm 发射，红色：625 nm 激发/713 nm 发射 )，用 SoftMax Pro 软件进行分析。

• HTRF 比值和数据处理都可以直接调用软件中根据 Cisbio 试剂盒预设的程序自动处理 。

  (http://www.cisbio.com/usa/drug-discovery/htrf-ratio-and-data-reduction)

• 平均值和标准偏差 (SD) 会在图中显示。

• 归一化过程：归一化【细胞因子】pg/mL =【细胞因子】pg/mL ÷ 活细胞数量。

细胞处理之前，人类 PBMC 的接种过程通过透射光成像监控和确认。这些细胞的直径小于 6 µm，用透射光计数单个细胞是非常困难的。因此，我们采用用户自定义的分析方法，通过计算图片上覆盖面积的百分比来计算细胞密度。

这种方法计算出19.7% 覆盖面积代表 50,000 PBMC/孔，35.9% 覆盖面积代表 100,000 PBMC/孔，计算比率为 1.82（数据未显示）。

结果证明，这种新的自定义数据分析方法成功识别了细胞数量，并使每孔的面积覆盖率达到了精确的百分比。

如预期，LPS 显著诱导 IL1β，IL6，IL8 和 TNFα 的分泌（图 1），IL2 和 IFNγ 在 5 ng/mL PMA + 1 µg/mL 离子毒素共同处理下释放量最大。

有趣的是，在 2 µg/mL 离子毒素存在的情况下，IL2 和 IFNγ 的分泌会显著下降（数据未显示）。

无论是 LPS 还是 PMA/离子毒素处理，地塞米松都会显著降低细胞因子的释放（图 2）。

EarlyTox 数据是通过红色标记计算细胞数量 ( 大小和荧光强度阈值 ) 和鉴定活/死细胞数量来分析的。使用 SoftMax Pro 软件中的分类功能，细胞核只标记了红色的为活细胞，细胞核标记红色和绿色的为死细胞。鉴定结果可以在软件中看到，细胞分别标记成了红色 ( 活细胞 ) 和蓝色 ( 死细胞 ) ( 图 3 和 4 ) 。