Hepatology：鉴定血清外泌体中与胆管癌相关的蛋白生物标志物

胆管癌（CCA）是恶性度较高的消化系统肿瘤。因其发展隐蔽且临床症状及体征出现晚，故给早期诊断带来困难。原发性硬化性胆管炎（PSC）是导致胆管癌的主要原因之一。在非侵染时期，鉴定肝内的胆管癌及肝癌（HCC）是非常困难的。目前尚未有准确区分CCA，PSC，及HCC的生物标记物。

为了寻找新的生物标志物，来自西班牙的研究者，利用高效的外泌体分离方法，分别从CCA、PSC，和HCC患者的血清样本中分离得到外泌体，运用蛋白质组学技术从中筛选出新的生物标记物，具有作为临床诊断工具的潜在应用价值，研究结果发表在国际著名期刊Hepatology上。

关键词：胆管癌，胆管炎，肝癌，biomarker，诊断

1、血清EV样本的选择、分离与鉴定

为了研究三者之间的区别，研究者选择了43例胆管癌，30例胆管炎，29例肝癌患者与32例正常人的血清样本，从中分离出细胞外囊泡(EV)作为研究对象。

通过使用纳米粒子跟踪分析（NTA）、圆形形态（透射电子显微镜）、大小（NTA为〜180nm直径）和标记物（免疫印迹检测CD9、CD63和CD81）表明，大多数血清EV是外泌体。

2、外泌体蛋白质组学分析鉴定样本间差异

研究者运用蛋白质组学分析鉴定病理样本中的差异表达蛋白，在健康人外泌体鉴定到541个蛋白，胆管炎外泌体鉴定到427个蛋白，胆管癌外泌体鉴定到574个蛋白，肝癌样本中鉴定到399个蛋白，然后对这些蛋白进行韦恩图分析，并且进行两两比较（图1）。

通过分析发现胆管癌中VNN1, CRP（C-reactive protein）, FIBG, IGHA1, A1AG1 and GGT1 这6个蛋白的表达量显著高于其他的三个样本，免疫印迹验证表明胆管癌样本中CRP显著性高表达，说明CRP蛋白显示出较高的诊断价值。

 图1  CCA、PSC、HCC和健康人群的血清EV比较分析

3、比较正常细胞和CCA细胞分泌的EV中蛋白组成差异

为了研究胆管癌细胞与正常细胞间的差异，研究者培养正常的胆管细胞、SV40侵染的无限增殖H69细胞与两种商品化的胆管癌细胞EGI1 、TFK1，分离出细胞外泌体，并对其形态及抗原特征进行对比分析。结果表明，4种样本的外泌体在形态及大小上没有显著的区别，免疫荧光分析发现两种胆管癌肿瘤细胞中CD63的量显著的高于正常细胞。 

图2 胆管癌细胞与SV40侵染细胞及正常细胞外泌体比较

然后作者进一步的对四种样本进行蛋白质组学分析。发现两种肿瘤细胞的蛋白差异不显著，与H69细胞和正常细胞均存在有显著性的差异，并且H69细胞蛋白比正常细胞更接近于肿瘤细胞。对差异蛋白的生物信息学分析发现，多部分差异蛋白与肿瘤发生发展密切相关，参与细胞增殖，炎症，细胞生存，分化，迁移等生物学功能。

 图3 肿瘤细胞与正常细胞外泌体蛋白质组分析

4、异种移植CCA，证实含有差异蛋白的外泌体能够在血清中释放

最后研究者在免疫缺陷小鼠的肝脏中原位植入人CCA细胞，证实了胆管癌CCA细胞外泌体中的差异蛋白能够在血液中鉴定到。为此研究者将胆管癌细胞注射到免疫缺陷小鼠体内，通过蛋白质组学分析小鼠血液外泌体，从中鉴定到23个人类的蛋白，证明肿瘤的外泌体可以分泌到血液中。说明血清EV中发现的新型蛋白质组学特征，具有作为诊断工具的潜在应用价值。

图4 CCA细胞外泌体能够释放到血液中

本研究通过对比胆管癌（CCA），原发性硬化胆管炎（PSC），及肝癌（HCC）的血清外泌体的蛋白差异，发现样本间的蛋白质组学特征。通过对人胆管癌细胞EV的蛋白质组学分析显示，与正常人胆管细胞释放的EV相比，其致癌蛋白的丰度更高。在免疫缺陷小鼠的肝脏中原位植入人CCA细胞，导致含有类似人致癌蛋白的EV在血清中释放。在CCA、PSC和HCC患者的血清EV中发现的新型蛋白质生物标志物，具有作为诊断工具的潜在应用价值。

参考文献

Ander Arbelaiz, et al. (2017) Serum extracellular vesicles contain protein biomarkers for primary sclerosing cholangitis and cholangiocarcinoma. Hepatology.

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