2019-08-26 18:20:23, 飞飞 赛默飞色谱与质谱分析
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韩春霞
糖基化分析的重要性
单抗药物是近年来发展最快的药物品种,在整个药物市场产值中已经占有超过12%的份额,超过1200亿美元。目前,全球已经批准的单克隆抗体药物超过了80个,年销售额增长率超过30%,主要应用于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、炎症性疾病等治疗领域。国内各大医药企业也聚焦于单抗药物的研发。
单克隆抗体结构主要由Fab和Fc两大功能区组成,在Fab段和Fc段特定的位点存在糖基化修饰。这些糖基化修饰发挥着极其重要的作用:能够维持抗体的空间构象、稳定抗体的结构,提高药物的热稳定性;糖链结构还能保护抗体不受某些蛋白酶水解,延长半衰期,提高药效;Fc段的糖基化修饰还会对抗体的安全性造成影响。因此抗体的糖型检测在产品质量控制中就非常重要。
目前的分析方法
绝佳的糖分析方法
高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法,是目前领先的糖分析方法,具有无需衍生、分离度好、灵敏度高、同时适用所有糖修饰形态等诸多优势。
对于单抗药物的复杂糖基化,离子色谱可以从三个方面给予解析:
N—糖基化修饰的糖链可以通过肽糖苷酶F或肽糖苷酶A酶切作用,或者肼解作用从糖蛋白上释放出来。糖链经净化后可直接进样,无需衍生,避免了衍生化过程中唾液酸化聚糖的结构改变。
Ofatumamab的N糖图谱(点击查看大图)
离子色谱还可以和高分辨质谱联用,实现对色谱峰的鉴别。以Q Exactive为代表的Orbitrap超高分辨率质谱对未标记的糖具有高灵敏度,可解析糖链结构。安培检测器、高分辨质谱和离子色谱联用,可同时解决糖链的定性和定量分析。
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单抗糖链主要由葡萄糖胺、半乳糖胺、岩藻糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、唾液酸等单糖组成。单糖组成测定可以从基础水平上对单抗的糖组成差异给出解析。
对于中性糖和氨基糖的分析,通常使用酸水解的方式,使蛋白中的单糖释放。样品水解后,直接进样,无需衍生。
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唾液酸存在于单抗的糖链末端,对于单抗在生物体内功能的发挥起着相当重要的作用,影响药物的有效性。唾液酸的差异,是人源抗体和其他生物抗体差异的一个指标。唾液酸的释放,可使用温和酸水解或酶解。使用离子色谱分析游离的唾液酸样品,可直接进样,无需衍生。不同结构的唾液酸在CarboPac PA10色谱柱上可以得到快速高效的分离。
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