有机相与高浓度的盐作流动相液相方法开发小经验

小编曾经用Thermo U3000高效液相色谱仪，用乙腈:0.1M KH2PO4（35:65，v/v）作流动相，发现随着分析时间的持续，出现各种异常现象。

正常色谱图

这些情况，小编实施了一些排查措施：

（1）方法方面，增加分析时间，避免复杂基质对后续测定的干扰。

（2）仪器方面，逐一排查仪器各个模块，包括色谱柱、检测器、自动进样器、泵。最后发现问题主要在泵模块。超声清洗单向阀后仪器可正常分析。然而，在单向阀清洗干净，分析时间延长的情况下，当连续分析时间过久时，如连续测试10h以上，以上问题又会发生。甚至会出现新的问题，如：多次发现比例阀不通。当疏通比例阀同时清洗单向阀后，仪器又可以使用。更严重的情况，疏通比例阀、清洗单相阀、清洗不锈钢连接管路、毛细管混合器和静态混合器后，压力依然剧烈波动，仪器无法使用。进一步排查后发现柱塞杆和密封圈已经被盐污染，密封圈甚至有轻微磨损。

为什么会这样，小编做了更深一步的思考：

（1）方法方面，流动相为乙腈:0.1M KH2PO4， 0.1M KH2PO4浓度非常高，虽然乙腈和0.1M KH2PO4（35:65，v/v）可以互溶，但当0.1M KH2PO4与纯有机相相遇时非常容易发生盐析。

（2）仪器方面，使用的液相泵结构图如下图：

由于实验时将0.1M KH2PO4放置于A通道，乙腈放置于C通道，使用泵的在线混合功能，混合乙腈和0.1M KH2PO4，因为0.1M KH2PO4浓度非常高，在与乙腈混合时，很容易在比例阀处发生盐析。乙腈放在下部的C通道，0.1M KH2PO4放在上部的A通道，由于重力作用，盐溶液可能会往下滴，当高浓度的盐溶液落到有机相通道时，就会发生盐析，有机相通道的出口就会逐渐被堵塞，最终只有部分甚至没有有机相进入后续的液相系统，故会发生色谱峰异常，保留时间延后，有机相（乙腈）通道purge无液体流出等问题。由于系统在比例阀处就有盐析出，而流动相还在不断冲洗，盐会继续被冲到后续部件，如单向阀、柱塞杆、密封圈、不锈钢连接管路、混合器等，导致故障发生。流路污染常常会导致系统压力波动，流路堵塞常常会导致系统压力过高。柱塞杆和密封圈受到污染和破坏后，泵会发生漏液，表现为压力波动。

对此采取了有效的方案:

（1）方法方面，预先将高浓度的0.1M KH2PO4和乙腈手动混合好，不再使用仪器的在线混合功能。

（2）仪器方面，根据比例阀上各流动相通道的位置，合理摆放流动相。纯有机相摆放在上部的A、D通道，盐溶液摆放在下面的B或C通道。问题得以解决。

说了这么多，最后总结一下用有机相和高浓度的盐作流动相时，液相方法开发小经验：

（1）等度洗脱时，最好手动将有机相和盐相混合成一相，尽量不使用仪器的在线混合功能；

（2）梯度洗脱时，注意正确设置有机相与盐相的比例，尤其是使用磷酸盐时，避免盐浓度过高时发生盐析。

（3）对于多通道低压梯度混合泵，应注意各通道流动相的摆放，有机相最好放置在比例阀上部对应的通道，盐溶液应放置在比例阀下部对应的通道。

（4）用过高浓度盐的流动相通道切换成有机相时，为避免流路里残留的盐与有机相发生盐析，需先用大比例的水置换清洗。同理，用过有机相流动相的通道切换成高浓度盐时，也要先用大比例的水置换清洗。

（5）保存在高浓度盐里面的色谱柱，如保存在150mM 磷酸盐（pH7）里面的SAX色谱柱，使用时若流动相里面含有有机相，色谱柱需先用水相置换清洗再通流动相。

（6）使用高浓度盐后的高效液相色谱仪，需及时清洗，并增加泵的维护频率。

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