2019-08-06 18:27:49, 检测家 北京携测技术有限公司
据海关通报显示,南京海关今年6月3日在一批加拿大输华猪肉产品中检出莱克多巴胺(瘦肉精)残留,生产企业名称为Frigo Royal (1998) Inc.,企业注册号为94。
*图片来源网络
6月14日,海关总署发布《关于加强加拿大输华猪肉莱克多巴胺检测的警示通报》(下称《通报》),要求加大对加拿大输华猪肉莱克多巴胺的抽检力度,抽检比例以总署风险布控要求为准,发现问题的一律作退运或销毁处理。
*文件截图
对于此,中国驻加拿大使馆在6月26日给出了回应,并指出涉事企业伪造官方兽医卫生证书。
使馆回应说,中方已立即暂停涉事企业猪肉产品输华。调查发现,该批输华猪肉随附的官方兽医卫生证书系伪造,并发现共有188份伪造证书。加方认为,该事件系刑事犯罪。这些伪造的肉类卫生证书通过加官方证书通报渠道发往中国监管部门,反映出加方输华肉类监管体系存在明显安全隐患。
为保障中国消费者安全,中方采取紧急预防性措施,要求加政府于6月25日起自主暂停签发对华出口肉类证书。中方希望加方高度重视此次假证书事件,尽快完成调查并采取有效整改措施,以更加负责任的态度确保输华食品的安全。
此次引起高度重视的莱克多巴胺,究竟是什么呢?在我们实验室的检测过程中,又需要注意哪些方面呢?
莱克多巴胺
据中国国家食品药品监督管理总局介绍,莱克多巴胺是一种β-兴奋剂类化合物,是由美国制药公司研究出的毒性小、代谢快的克伦特罗替代品,属于第二代“瘦肉精”。
它在临床上主要用于治疗支气管哮喘、充血性心力衰竭症和肌肉萎缩症等。
*莱克多巴胺分子式,C18H23NO3,分子量301.39
当饲料中添加剂量为治疗剂量的5~10倍时,会改变养分代谢途径,促进营养成分由脂肪向肌肉转移,瘦肉量可以增加10%以上,经济回报高,又具有一定的检测欺骗性。
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尽管常规剂量的瘦肉精类药物可在机体内被代谢并排出体外,但过量摄入莱克多巴胺,人体会出现不同程度的中毒反应,其症状与动物中毒症状相似,表现为肌肉震颤、四肢麻痹、心动过速、心律失常、腹痛、肌肉疼痛、恶心眩晕等症状,重者可引发高血压、心脏病甚至死亡。
各国对莱克多巴胺在养殖业适用范围的规定不尽相同。在美国等国家和地区,莱克多巴胺可作为瘦肉精被允许用于畜禽养殖,以提高动物的蛋白质含量和瘦肉率;但在欧盟、中国、俄罗斯等国,畜牧养殖中该类药物被全面禁止。
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源头上进行检测监控
由于莱克多巴胺在进入机体后经过代谢,会形成不同的代谢产物,在进行组织、血清或尿液高效液相色谱检测时具有一定的欺骗性,有时会因为阳性证据不足导致漏检。
因此从源头上进行控制,对饲料中莱克多巴胺进行检测和监控不失为控制莱克多巴胺滥用的良好途径。
检测方法
目前对饲料中莱克多巴胺的检测方法主要为酶联免疫法(ELISA)、胶体金层析法(GICA)、高效液相色谱法(HPLC)及气相色谱-质谱法(GC-MS)。
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ELISA通常作为筛选方法,即进行定性分析,检测限为0.01 mg/kg,线性范围通常在0.005~0.05 ng。
胶体金免疫层析法也是一种适合于大规模筛选的检测方法,检测限可以达到5 ng/kg。
HPLC是最为常用的实验室莱克多巴胺定量检测方法,检测限为0.1 mg/kg,线性范围通常在2.5~10 ng之间。
GC-MS法是定性和定量分析方法,并且在国内外都被作为莱克多巴胺检测的仲裁方法,其定量限为0.05 mg/kg,线性范围为0.05~1.0 ng。
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不同检测方法具有不同的前期处理方式,样品前期处理会对检测结果造成影响:
不规范的前期处理方法导致结果重现性差,以及不同测试方法或同一测试方法不同重复之间的不匹配性。
随着分析技术的日趋成熟,对莱克多巴胺的分离和鉴定渐趋简化。而前处理时间几乎占据整个分析时间的80%,是决定分析测定效果的关键。
前处理方式分析
适当的和标准化的样品前处理对于获得相同方法之间的一致性和不同检测方法之间的匹配性具有非常重要的意义。
酶联免疫法
酶联免疫法是目前进行大规模莱克多巴胺检测最为常用的方法。
酶联免疫法样品的前处理比HPLC和GC-MS简单一些,通常是利用乙酸乙酯及甲醇进行萃取和溶解。
1、首先利用甲醇和PBS(9:1)制备的提取液对样品进行充分溶解
2、然后加入碱性缓冲液调节并维持其pH值,使莱克多巴胺转变成莱克多巴胺单体
3、最后加入乙酸乙酯进行萃取。将有机相与水相进行分离后,氮气吹干有机相即完成莱克多巴胺的提取
4、加入甲醇溶解后可以进行ELISA测试。
*目前ELISA法检测饲料中的莱克多巴胺只有地方标准,尚没有统一的国标法可以参考。
在用于ELISA检测方法的样品前处理过程中需要注意的问题是:对样品溶解及萃取过程振荡或涡旋要充分;在转移有机相的过程中要避免吸入脂肪层。
伯腾仪器 酶标仪
BioTek ELX800 ELISA
胶体金免疫层析法
利用胶体金免疫层析法快速检测饲料中的莱克多巴胺是近几年发展起来的非常有市场前景的一种方法,目前也有商品试剂盒出售。
但由于莱克多巴胺出现时间较短,饲料中的莱克多巴胺检测尚处于起步阶段,没有统一的国标法及地方标准可以参考。而且抗原抗体反应是特异性很强的免疫反应,样品处理不当可能会减少特异性,进而增加假阳性率。
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胶体金免疫层析法检测莱克多巴胺的前期处理比ELISA方法简单一些,无需洗板机等特殊仪器设备。
1、首先称取适量的样品加入甲醇/水(4:1)
2、提取液用均质器混匀
3、离心分离提取液与固体残渣
4、将离心上清液进行二次离心或过滤
5、加入阴性磷酸盐缓冲液即可用于检测
需要注意的是:
1、为减少介质的影响,在配制标准品时,做饲料萃取时最好采用已知阴性饲料的甲醇/水(4:1)萃取液,再用阴性磷酸盐(1:10)稀释后的溶液来配制
2、实验需同时处理相同量已知阴性饲料用做对照
3、在操作过程中要避免吸入脂肪层,后者非常容易影响抗原抗体反应
4、结果应在5~8 min读取,超过10 min的样本检测判读无效。
高效液相色谱法
高效液相色谱法是目前对莱克多巴胺进行定量分析的最常用方法。
用于HPLC检测对检测样品的要求较高,因此饲料样品前处理比ELISA法和胶体金免疫层析法要复杂的多,包括试样提取、试样净化和定容等步骤。
1、试样提取:
通过氨/甲醇溶液及超声振荡方法分离莱克多巴胺,通过离心将上清液与饲料残渣分离,取上清液进行不高于50 ℃的旋转蒸干
2、试样净化:
第一次净化包括用甲醇(溶解莱克多巴胺,位于下层)和正己烷(萃取抽提脂肪,位于上层)溶解前期样品提取过程中旋转蒸干的残余物,充分萃取后取出甲醇层进行氮气吹干。
第二次净化包括乙酸乙酯溶解吹干物,加少量无水硫酸钠,过固相萃取柱,用甲醇/乙酸乙酯溶液洗脱收集,氮吹至干
3、定容:
最后用乙酸进行定容,过滤后上机。
*具体操作方法可以参考GB/T 20189—2006。
莱克多巴胺属于苯酚型β2-受体兴奋剂,易溶于稀酸溶液和碱性溶液,其提取方法可以用稀酸溶液提取,也可以用有机试剂提取。
采用2%的氨水甲醇溶液进行提取,用氨水进行碱性化后,可以有效去除脂肪和非极性杂质,从而保证甲醇提取杂质相对较少。
由于是作为定量方法,因此需要注意实验室内平行测定间的相对偏差不大于10%;而不同实验室间测定的相对偏差应不大于15%。
赛默飞 液相色谱
Thermo U3000 HPLC
沃特世 液相色谱
Waters e2695 HPLC
气相色谱-质谱法
气相色谱-质谱法是目前公认的定性和定量方法,除作为普通检测方法外,当免疫学方法与HPLC等方法检测结果发生冲突时,用来作为仲裁方法。
与HPLC方法相比,GC-MS方法样品前处理同样包括试样提取和试样净化两个步骤。由于增加了质谱法,因此净化步骤结束后还包括一个试样衍生过程。
蒸发剩余物加BSTFA(双三甲基硅基三氟乙酰胺)及TMCS(三甲基氯硅烷),于旋涡混合器上震荡,在80 ℃的烘箱中加热,氮气吹干,加甲苯溶解。
在碱性环境下将饲料中的莱克多巴胺以分子形式分离出来,然后利用莱克多巴胺较强的极性用乙酸乙酯进行萃取,再利用盐酸溶液进行反萃取,将脂溶性杂质留在有机相
保证莱克多巴胺提取物的质量,可以利用莱克多巴胺的极性特点,通过阳离子交换柱进行纯化,最后利用氨化甲醇洗脱。
在GC-MS检测过程中,需要注意莱克多巴胺存在4种光学异构体,用柱子分离光学异构体确认有复数峰时,应以各峰高或峰面积的和计算。
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