液相色谱检测器版“狮子王”之UVD vs DAD

    小编在周末休息时间去电影院重温了一遍儿时的经典《狮子王》，老狮王木法沙胞弟“刀疤”一心想除掉木法沙和辛巴，继承王位，奈何实力还是不允许啊。一向脑袋里天（qian）马（qiang）行（fu）空（hui）的小编怎么会放过这个题材--UVD：“大哥，你究竟比我强在哪？”DAD：“咳咳，你去问小编啊！”

    其实小编在日常的客服工作中经常会遇到客户对于UVD紫外检测器和DAD二极管阵列检测器之间有什么区别、DAD相对于UVD有哪些更强大的功能等方面提出相似的疑问，其次很多客户反馈在使用DAD的过程中也有些许疑惑，一些参数的意义以及怎么设置并不明晰，那今天咱就详细的讲一讲吧。

一、原理上：

紫外检测器先分光，取得单色光再通过流通池，用光电二极管检测，只能获得特定波长的信号；

二极管阵列检测器复色光先通过流通池，再分光，整个光谱由二极管阵列检测，同时获得一段光谱范围内信号。

二、光路系统：

图一：UV-Vis光路示意图

图二：DAD实际光路示意图：光源发出的连续光经过聚光镜、谱钕滤光片后，通过流通池，再经过全息光栅色散成单色光照射到二极管阵列检测元件上进行检测，由于经色谱柱流出样品组分变化（通常不同结构化合物对入射光吸收存在差别），照射到光电检测器上的各个波长的光强有区别，因此我们可以看到各个大小不一的谱峰。

借助两者光路图我们可以更清楚的了解上面关于两者原理的对比。

三、功能上：

What？时间-波长-吸光度三维谱图是神马？我努力的截取了它完美的“侧颜”：

时间-吸光度二维谱图依然是那么Classic：

    好啦，精彩的图片看的过瘾吧，对UVD和DAD有初步认识了吧？说了这么多，在实际应用上DAD到底有什么过UVD之处啊？不急不急且看下面的应用栗子：

   DAD应对中药行业中的应用---染色问题

1.延胡索中金胺0的检测

2.金橙

3.柠檬黄

好啦！先简单列这些应用吧 ，我们有完整的解决方案之“DAD应对中药行业中的应用---染色问题”，欢迎新老客户朋友来电或留言索取！

    DAD检测器在应用于制备色谱实际样品的分离纯化中有哪些优势呢？我们总结了下列几点：

1. 提供化合物丰富的光谱信息——如同拥有一台紫外分光光度计。
倘若用户对自己所分离的样品足够了解，便可根据目标分子的结构信息大致判定当前流出组分是否为目标结构。

2.提供最佳检测波长，增强检测灵敏度——减少样品的损失。
当采用自动收集器进行样品收集时，系统根据预设吸光度值进行收集，当遇到某些吸收弱的化合物或者进样量低而吸光度较低时，通过选择更佳的吸收波长能够有效减少样品的损失。
注意：进行样品分离纯化实验时，并不总是选择样品的最大吸收波长，我们要根据样品量选择合适的吸收波长。当进样量很小时，我们选择吸收较大的波长；当样品量较大的时候，为了防止吸收饱和，我们可以选择吸收较低的波长，这样更有助于收集样品。

3.提供样品纯度的判断依据——使实验结果更精准可靠。
分离样品时，当出现两种样品洗脱时间相似，样品洗脱峰发生重叠或交叉的情况时，依据洗脱组分前后所有波长光谱吸收变化，可大致判定该组分是否为单一组分或混合组分。

此外，还可以通过同一化合物特定波长吸收比相同的原则对洗脱组分的纯度进行判别。

  “看了以上的案例还是觉得云里雾里呢，你不是要跟我们讲DAD的一些参数的意义以及怎么设置的原理吗？你不结合工作站讲这些我们仪器操作者比较关心的点那就是耍流氓~”

“哈哈，来喽来喽，他们真的来喽。”接着我们就仪器操作者比较关心的参数设置来仔细探讨下：

就以RIGOLUltraChrom为例，我们来看看工作站方法设置。

（实验方法是药典、标准等既定方法规定的，按照方法中的要求设定方法。）

RIGOL Ultrachrom 工作站方法设置，我们还是举个实际应用栗子：这个方法，用紫外检测器得跑三遍，但用DAD可以一次搞定，如何设置，看下图：

紧接着，我们来详细的解读DAD方法中参数：

【一般情况下】

样品波长：按照方法要求选择检测波长，可以参考下文中的详细说明。

样品带宽：主要影响峰高和基线噪音，因此优化带宽可以获得最佳信噪比；样品带宽选择的最直接依据是其吸收光谱中峰的峰宽，详见后面的解释。4nm是比较通用的样品带宽。

参比波长：选择合适的参比波长可以减小梯度洗脱过程中的基线漂移，甚至可以通过优化参比波长对共流出峰（没分开的峰）做分别检测。一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域，请参考下文详细说明。

参比带宽：是参比波长取值的波长范围，影响参比波长设置的实际效果。参比带宽至少要与样品波长的带宽相等，许多情况下选择100nm作为缺省值，如果在不想用参比波长的情况下，也可以直接将带宽设置为0（或去掉参比波长前面的勾，如Agilent仪器）。

波长范围：是工作站采集3D光谱数据的波长范围。一般按照方法要求，没有要求则需要包含所有被测物质的检测波长，但是较宽的波长范围采集会占用更多的磁盘空间。

步进: 一般选择1nm，步进的选择对谱带数据点数有影响。

采样率/峰宽：采样率和峰宽是同一目的的两种不同实现方式，其目的都是为了真实的采集到一个色谱峰。一般选择10Hz。采样率高能更真实的还原峰型，但会带来更大的基线噪音。反之过低的采样率会导致峰变形，但基线噪声更小。选择合适的采样率以获得最佳的信噪比。

曝光时间：这是RIGOL L-3520 DAD的一项高级参数设置，一般选择20ms

滤波设置: 这同样是RIGOL L-3520 DAD的一项高级参数设置，快/正常/慢/无，一般选择正常

 要弄明白一般为什么这样设置，请您接着看每个参数的意义~

1.样品和参比波长及带宽

简单说：你看到的色谱图上的最终吸光度值是这么来的：

吸光度=以样品波长为中心在样品带宽范围内的所有波长吸光度平均值-以参比波长为中心在参比带宽范围内的所有波长吸光度平均值

这个吸光度是实时计算的，你看到的色谱图中的每一个点，都是这个公式计算来的。（当然如果关闭了参比波长，就没有后半截了） 

晕了吧？ 

打个比方，检测器方法中的信号 A 设置为样品 254.0/4、参比360.0/100，即从 252到 256 nm 波长范围内的平均吸光度减去从 310 到 410 nm 波长范围内的平均吸光度。

有什么用？

想一想，我们在走梯度，流动相的组成时时变化，导致基线漂移，大家应该经常遇到。为啥会这样？主要因为流动相变化时：

（1）流动相组成变化导致背景吸收变化（尤其是检测波长比较短的时候，如203nm）；

（2）流动相组成变化导致折光系数改变（这个是流通池里面光折射的物理的影响）。

现在回顾下上面的公式，其实：

吸光度=(样品吸收+背景吸收)-(参比吸收+背景吸收)

如果我们把参比波长选在一个样品没吸收的地方，则：

吸光度=(样品吸收+背景吸收)-(0+背景吸收)

换句话说，背景变化被扣掉了所以基线不飘了！

就像下面这样：

所以，老铁们，用DAD时，正确选择参比波长，是纠正基线漂移的法宝。

还有，一般参比带宽都选的那么宽，为啥？

因为，带宽越宽，被平均的数据点越多，偶然性变化带来的影响越低，背景扣除越准确稳定。100nm是比较常用的参比带宽。但参比带宽范围内注意不要有吸收，否则会降低峰高，搞不好出来一堆倒峰。

样品带宽为啥多数是4nm？

样品带宽决定了样品信号平均的波长范围，显然带宽越宽，平均的越多，基线越稳定。但如果太宽了，峰的高度和光谱的分辨率都会受影响。

这里只要记住，带宽宽，基线噪声小，峰高降低；带宽窄，基线噪声大，峰高受影响小。如下图：

一般4nm就可以了~

2.步进

就是采集光谱时，离多远采集一个数据点。步子大了，得到的光谱图清晰度不够；步子小了，会产生大量的数据迅速填满你的磁盘。而光谱图的清晰度，又会影响峰纯度分析时的准确性，所以选择什么样的步进，还要看看以后的用途。

3.采样率/峰宽

采样率和峰宽是同一目的的两种不同实现方式，其目的都是为了真实的采集到一个色谱峰。一般选择10Hz，采样率高能更真实的还原峰型，但会带来更大的基线噪音。反之过低的采样率会导致峰变形，但基线噪声更小。选择合适的采样率以获得最佳的信噪比。

来张图就明白了~

4.曝光时间

曝光时间属于RIGOL L-3520 DAD高级选项，曝光时间与采样率有负相关，同时也跟曝光次数有关。一般选择20ms就可以满足要求了，不需要用户做过多设置。 

5.滤波

滤波属于RIGOL L-3520 DAD高级选项，滤波是针对采集后的基线做了微小的处理。滤波目前有四种速度，分别是快、正常、慢和无。滤波速度越慢滤波相对效果会好一些，但是平常使用选择正常就可以了。

根据上面那么一长串的参数设置以及参数意义介绍，你们是不是能设置方法而做出来谱图数据啦？那必须的嘛！不过我们也得学学怎么来看懂三维视图数据：PDA视图分析

3D谱图可以比较直观地查看 信号-时间-波长 三维视图，通过调整等高图中横轴(波长轴)即样品的检测波长，纵轴(时间轴)即保留时间，可以得到合适的色谱图和光谱图，通过峰纯度可以确定检测峰是否含有其它物质。确切地说，每种一定浓度范围内的具有紫外吸收的物质都会有其独特的光谱图，通过比较对照品与供试品谱图目标峰的保留时间范围内的光谱图，如不相同则不含待测物质。

DAD好是好，但是我们也得懂的基本的维护保养呀，下面我们就来看看在日常使用DAD时可能会遇到哪些常见的问题以及解决方法：

1.浓度太高超量程平头了

1.浓度太低噪声已经掩盖了部分峰

这两种情况的处理方法：适当地增减样品的浓度，保证光谱图在合适的浓度范围内显示。同时也需要考虑到流动相的温度、成分或PH值的变化。

以下是一种或多种因素可造成吸光度光谱的形状差异：

（1）检测器噪声(流动相温度的变化)

（2）高浓度样品引起测光误差(应将化合物的最大吸光度控制在1AU以下)

（3）流动相PH值或成分改变（如下图所示）

2.色谱图出现倒峰的问题

这种情况的处理方法：在3D谱图里观察最大吸收波长出现倒峰，可能是因为你选的参比波长不合适。

DAD的日常维护保养跟UVD差不多：主要在氘灯以及流通池。

氘灯属于耗材，在氘灯使用寿命到达极限后，会带来基线噪音增大，线性变差等问题。这时需要用户自行更换氘灯。更换条件：氘灯使用寿命为2000h，当信号噪声增大，能量明显降低时，考虑更换。

清洗流通池

流通池在长期使用后，若能量降低，灵敏度变差，噪声变大，而氘灯使用时间不长，则考虑可能是流通池被污染，需要对该部件进行清洗。

步骤如下：

（1） 关闭检测器，关闭高压输液泵，取下色谱柱，将泵的出口管路与流通池的入口管路相连。

（2） 如果流动相与水相不溶，需要使用一种过渡的溶剂替换原有的流动相冲洗管路和流通池。

（3） 使用十二烷基磺酸钠、盐酸（1M）、氢氧化钠（1M）、异丙醇或乙醇中的一种溶剂冲洗流通池。

（4） 清洗完毕后，再使用HPLC级的水将管路和流通池中的清洗液冲洗干净。

（5） 将色谱柱重新安装至液路系统中。

口干舌燥啊---------------

最后的最后，看在我讲了这么多干货的面子上，允许小编给大家简单的介绍下RIGOLL-3520二极管阵列检测器的一些技术参数吧~

RIGOL L-3520 DAD优质的做工和卓越的技术指标，值得拥有！UltraChrom色谱工作站简洁明了、功能强大更能助您一臂之力！

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