如何确定键合到Wang树脂上的氨基酸的mmol量？

虽然市场上已经有非常多可以直接买到的预载入Wang树脂类型的氨基酸，但仍然会有一些情况会需要在试剂买来后再将氨基酸键合到Wang树脂上，例如，C-端需要接一个非天然氨基酸的时候，可能市场上并没有相同的产品，这时就只能自己进行化学键合操作。

可是在自己进行键合的时候，我们该如何确定具体的键合数目呢？

我们遇到过一些课题组在偶联上第一个氨基酸之后，会直接进行剩下的多肽合成，在没有确定实际的键合载样量的情况下，会使得反应物使用量增加，如果是非天然类氨基酸，往往价格都比较高，这样的做法无疑使得成本升高；在确定了具体的键合数后，就能有效的减少废品产生和成本消耗。

为减少氨基酸消耗量，增加原料使用效率，提高反应精确性，我们为您提供一个方法来对第一步氨基酸的键合载样量进行检测和分析。

此次我们提供测定载样量的方法虽然描述比较简单，但要获得精确的载样量数值，则需要有良好的分析技术，此方法通常是在反应结束后进行测定，有时候也可以通过此方法检测反应的进程。

Fmoc-piperidine在300nm下有很强烈的紫外吸收，我们可以通过紫外吸收的变化（朗伯比尔定律）来确定载样量。

A=特定波长下的紫外吸收；

ε=分子消光系数

l = 流动池长度

c = 样品浓度 mol/L.

以下为测定成功偶尔到树脂上数目的常规步骤。

1.     按照文献步骤添加氨基酸，见此链接

2.     从反应容器中取出少量的树脂，再将其移至预先准备好的小瓶中。

3.     将转移出来的树脂进行清洗，以除去残留下来的DMF，通常情况下可以使用不同的溶剂进行多次清洗以保证DMF完全除净，例如交替使用DCM和乙醚清洗Peg树脂。

4.     洗净后真空干燥，为确保数据不出现太大偏差，此步骤操作一定要确保非常干燥。

5.     干燥后称重。

6.     将树脂放入到已知体积的含有20%哌啶的DMF溶剂当中，然后通过标准方法进行F-moc脱保护操作。

7.     收集所有F-moc脱保护操作的全部溶液，此时要保证样品不能有任何损失。

8.     在把含有20%哌啶的DMF溶剂进行紫外校零后，用干净的20%的哌啶DMF溶液对F-moc脱保护溶液进行稀释，稀释的量取决于用于此次分析的树脂的用量以及脱保护溶液的体积，另外，朗伯比尔定律只与吸光度存在互为线性比例关系，吸光度的值的范围在0.1-1AU之间。

9.     在301nm的波长条件下，检测稀释后脱保护溶液的吸光度。

通过朗伯比尔定律计算出在脱保护过程中释放出来的Fmoc的mmol量，使用这种稀释方法，Fmoc-piperidine的消光系数可达6000 M-1·cm-1 ，另外不要忘记此计算中需要更正的稀释系数，Fmoc的mmol量和键合到Wang树脂上面的氨基酸成正比例关系。

通过得到的Fmoc的mmol量即可换算出键合到树脂上的起始氨基酸的mol量。