勃林格殷格翰发布新研究：Aura赋能多肽制剂颗粒风险整体性评估

剪切应力（Shear stress）、界面应力（Interfacial stress）、搅拌诱导应力（Agitation-Induced stress）、空化作用（Cavitation）和冻融应力（Freeze-thaw stress）等多种物理应力，对肽类药物的物理稳定性具有关键作用。

其中：剪切应力源于流体运动产生的切向力，常与搅拌、泵送等工艺相伴；搅拌诱导应力由溶液晃动引起；而冻融过程则因低温、冰晶及辅料浓度变化对分子施加应力。这些应力均可导致肽类聚集，形成亚可见颗粒（SVPs），且聚集形式包括均相（protein-protein）与异相（protein-particle）。鉴于肽与蛋白质结构相似，推测其在物理应力下行为类似。

近日，来自德国勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）的研究者在《European Journal of Pharmaceutical Sciences》上发表了题为"Holistic evaluation of particle formation induced by physical stress in liquid peptide solutions"（多肽类制剂溶液中物理应力诱导颗粒形成的整体性评估）的文章，系统评估了液态多肽溶液在物理应力作用下的颗粒形成风险。

图1. 展示了本文的整体研究逻辑：先建立可靠的物理应力模型，再将肽溶液分别暴露于搅拌、振荡、泵送和冻融等应力下，最后结合目视检查、BMI颗粒分析、浊度和HPLC结果，对肽类液体制剂的物理稳定性进行系统评估。

在振荡应力方面，这篇文章也给出了一个很实用的结论：不是所有“摇晃”都足够敏感。使用玻璃瓶轨道振荡（420 rpm，10天）时，整体区分度较低，基本只有Peptide A在个别样品中表现出明显响应；但当作者把体系切换到96孔板、并将振荡速度提升至1,200 rpm后，Peptide A、Peptide C和Peptide F的颗粒增加就更清晰地被放大出来，其中Peptide A还伴随可见浑浊和吸光度升高。换句话说，微孔板高转速振荡虽然体积更小，却可能因为更强的界面应力而更适合作为早期高通量筛选工具。

而在蠕动泵循环实验中，结果又呈现出另一种图景：这里的区分度不像搅拌那样集中于某一个“最差分子”，而是多数肽都会在2 h循环后出现颗粒增加。除Peptide E和Peptide G外，其余肽均出现不同程度的SVPs上升，其中Peptide F反应最快，0.5 h即可观察到变化，Peptide A在1 h后出现增加，Peptide B和D在1.5 h后上升，Peptide C则在2 h后才明显变化。不过，这一过程中并未观察到明显浑浊，也没有吸光度升高，提示蠕动泵更可能优先诱导小尺寸亚可见颗粒，而不是快速形成肉眼可见聚集物。作者据此推测，蠕动泵挤压管路带来的“milling effect（研磨样效应）”可能是重要机制之一。

冻融结果则提醒我们，冻融研究并不总能直接等价为“分子冻融稳定性”。在该研究中，只要将西林瓶中的样品冻到-50°C，再回温，空白缓冲液本身就会产生明显SVPs增加，因此作者认为这里很可能夹杂了玻璃脱片/玻璃层裂等容器因素，而不是单纯由肽分子聚集造成。这意味着：如果冻融模型没有先排除包材贡献，那么所得结论就可能高估分子的冻融脆弱性。作者也明确提出，该方法仍需进一步优化，例如调整冻结温度至-30°C左右，或更换适合冻融的瓶型。

值得注意的是，尽管多个应力条件下都观察到了SVPs甚至肉眼可见的浑浊，HPLC结果却显示各肽样品的主峰含量并未明显下降，且共价高分子峰（HMWPs）也未增加。这说明本文观察到的颗粒，并不一定对应“共价二聚体/多聚体”的大量生成，更可能是弱相互作用驱动的非共价聚集，或者是以外源颗粒为核心诱导的异相聚集。这一点对分析策略也很有启发：如果只盯着SEC或主峰回收率，很多物理不稳定信号可能会被漏掉；而BMI这类颗粒分析方法，恰恰可以补足传统含量/纯度方法看不到的那部分信息。

首先，作者强调，肽类药物在整个生命周期内都会经历搅拌、振荡、泵送、冻融等多种物理应力，这些应力既可能来自生产配液和灌装，也可能来自运输和储存；因此，多肽类制剂的物理稳定性评价不能只看单一场景，而要尽量贴近真实工艺过程。

第二，不同应力的区分能力并不一样。在本研究中，搅拌是最能拉开肽之间差异的条件，Peptide A对搅拌最敏感；而传统玻璃瓶轨道振荡虽然方法建立成功、空白背景较低，但对多数肽的应力强度可能还不够。相比之下，96孔板高转速振荡更适合早期高通量筛选，因为它在低体积条件下提高了应力水平，也放大了不同肽之间的差异。

第三，作者认为Peptide A是这组分子里最“脆弱”的代表。它不仅在搅拌和振荡条件下最容易形成亚可见颗粒，还出现了可见浑浊。更有意思的是，氮气顶空能明显降低其颗粒形成，而氩气却没有表现出同样效果，提示其不稳定机制可能与氧化、界面作用以及材料相关成核共同有关，而不是单一因素。作者还提到，Peptide A的部分颗粒带有外源核心特征，说明搅拌过程中产生的玻璃微粒可能成为肽聚集的成核中心。

第四，蠕动泵实验说明，泵送对肽类也可能是一个现实风险点。作者推测，蠕动泵更可能优先诱导小尺寸颗粒形成，这可能与管路被反复挤压带来的“研磨样效应”有关。与此同时，Peptide E和Peptide G在该条件下相对稳定，提示肽的序列或分子设计会显著影响其抗物理应力能力。

第五，冻融结果提醒大家，方法本身也可能“造颗粒”。研究中，当样品冻到-50°C时，即使是空白缓冲液也会出现明显颗粒增加，作者推测这可能与玻璃层裂/脱片有关，而不一定是肽本身发生了聚集。因此，冻融方法还需要进一步优化，比如调整冻结温度或更换瓶型，否则很难真正用来区分分子本身的稳定性差异。

最后也是文章最有意思的一个结论：虽然不少样品在物理应力下出现了亚可见颗粒，甚至部分出现肉眼可见浑浊，但HPLC主峰含量并没有明显下降，共价HMWPs也没有升高。这说明这些颗粒更可能是非共价聚集，或是由外源颗粒诱导的异相（蛋白-颗粒）聚集，而不是传统意义上的大量共价多聚化。作者据此认为，多数测试肽其实对物理应力表现出较好的内在稳定性，未必都像抗体药物那样需要常规加入表面活性剂；真正可能需要重点优化处方的，是像Peptide A这种表现出“抗体样聚集倾向”的分子。

文中使用的是：Waters（原Halo Labs）Aura+多功能颗粒分析仪

Aura（Aura BMI设备）在本文中的贡献，不是一个简单的方法学点缀，而是整篇研究的“数据引擎”。它的价值主要体现在以下三个扎实的技术层面：

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提供了整篇研究最核心的颗粒定量数据

作者用Aura BMI对样品中≥2 μm的亚可见颗粒（SVPs）进行计数，并明确将这一指标作为主要评价终点，因为它代表了BMI可获得的总颗粒信息量最多。正是基于这些数据，文中才能比较不同物理应力条件下的颗粒生成水平，并判断哪些肽对搅拌、振荡、泵送或冻融更敏感。图2的方法建立数据、图3中不同肽在四类物理应力下的颗粒比较数据，以及图4A中Peptide A在空气/氩气/氮气顶空条件下的颗粒差异，都是由Aura BMI测得。可以说，凡是文中围绕“颗粒有没有增加、哪种应力更强、哪条肽更敏感”展开的核心主线，基本都建立在Aura的结果之上。

2

支撑了方法学建立和高通量筛选

Aura BMI的检测流程天然适合早期制剂开发：文中每孔仅使用30 μL样品，并采用96孔板形式进行分析。这使研究者能够在样品量有限的情况下，同时比较多个肽、多种应力和多个时间点，并快速完成图1虚线框所示的方法建立过程。也正因为有Aura BMI，作者才能筛出哪些条件背景较低、哪些条件会因开孔操作、泵管或深度冻融而引入额外颗粒；同时也才能在图3中进一步看出，不同stress model的区分能力并不一样 - 例如搅拌更容易拉开肽之间差异，96孔板高转速振荡进一步放大了样品间差别，而蠕动泵则会让多数肽出现亚可见颗粒增加。

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结合SIMI，为颗粒来源判断和结果解释提供了关键线索

Aura BMI不只是“数颗粒”，它还结合了SIMI对颗粒进行表征。文中明确写到，SIMI-positive颗粒被归类为外源性颗粒。在Peptide A的搅拌实验中，作者观察到部分颗粒呈现外源核心特征，由此推测可能存在“玻璃颗粒先成核，再诱导肽聚集”的过程。与此同时，Aura的数据还能与图4中的其他分析形成互补：虽然图4C、4D、4E显示部分样品并未出现明显吸光度升高、主峰含量下降或HMWPs增加，但Aura仍已检测到SVPs上升。这说明它不仅能做颗粒计数，还能更早暴露传统外观检查和常HPLC尚未充分反映出来的物理不稳定风险。