当细胞自带“滤镜”，光谱流式如何还原真实免疫表型？

细胞内多种内源性分子（如芳香族氨基酸、脂褐质、吡啶核苷酸、黄素辅酶）在特定波长激发光下会产生自发荧光，其水平随细胞类型、代谢状态和实验条件变化。自发荧光在传统流式细胞术中会增加噪声、降低检测灵敏度，并可能导致高自发荧光细胞群被误判为阳性。光谱流式细胞术利用波长检测器阵列同时捕获荧光素与自发荧光光谱特征，通过识别样本自发荧光特征实现信号分离，提升定量准确性和检测分辨率。安捷伦 NovoCyte Opteon 光谱流式细胞仪（最多配备 5 根激光、73 个检测器）可高分辨率采集数据并表征自发荧光光谱，NovoExpress 软件可识别未染色样本的不同自发荧光光谱并优化解析过程，避免冗余光谱引入误差。

本研究覆盖新鲜人血细胞、质控血、小鼠脾脏细胞与肺细胞，验证去除自发荧光可显著提升结果分辨率与准确性。异质性高的样本需复杂提取策略，均一性样本可用简化策略。NovoCyte Opteon 搭配 NovoExpress 软件可高效实现自发荧光提取，获得最佳分析效果。

安捷伦 NovoCyte Opteon 光谱流式细胞仪

细胞自发荧光水平受细胞类型、大小、代谢状态、实验条件等多种因素影响。图 1 展示不同未染色样本在所有荧光检测通道的荧光强度分布。值得注意的是，未染色质控血中各细胞群自发荧光强度不同，但光谱特征相似；与之对比，未染色小鼠肺细胞不同亚群的自发荧光光谱差异显著。样本类型相同时，质控血淋巴细胞自发荧光远强于新鲜人外周血淋巴细胞。

图 1. 不同样本中未染色细胞群的密度光谱图。A. 包含所有细胞群的未染色人类质控血样本。B. 包含所有细胞群的未染色的小鼠肺细胞。C. 未染色的新鲜人类血液样本中的淋巴细胞。D. 未染色的人类质控血样本中的淋巴细胞。

人血样本各细胞群自发荧光光谱高度相似，光谱解析过程中加入一种自发荧光光谱即可完成提取。以新鲜血样本为例，基于 FSC/BSSC 图圈选淋巴细胞群并设为自发荧光群体（图 2. A 和 B）。由于新鲜血样本自发荧光信号弱，解析结果在扣除与不扣除自发荧光条件下无明显差异（图 2. C）。因此，自发荧光信号低且均一的样本，可选择是否在解析中加入自发荧光光谱。

然而，人质控血样本自发荧光信号显著增强。全染色样本解析时整合自发荧光扣除可有效消除自发荧光背景，提升细胞群区分度（图 2D）。因此，目标细胞群自发荧光强且均一时，在解析步骤中加入自发荧光扣除可大幅提升特定细胞群识别的分离度与准确性。

图 2. 7 色人血免疫表型检测 panel 中自发荧光提取的影响。A. 未染色新鲜人血样本中淋巴细胞的 FSC/BSSC 圈门。B. A 中淋巴细胞的光谱特征。将包含或不包含自发荧光光谱的全染色样本的解混结果进行比较，C. 新鲜人血样本。D. 人质控血样本。

图 3A 中，未染色小鼠脾脏细胞光谱密度图显示，多数细胞自发荧光特征一致，少数亚群呈现不同自发荧光图谱。为系统表征所有自发荧光有差异的细胞群，先通过 FSC/SSC 图圈选目标细胞群，排除碎片与死细胞。后续选自发荧光信号差异通道的光谱密度图与二维图分析（未展示），识别出两个具有独特自发荧光特征的群体 A1 与 B（图 3B）。采用 NovoExpress 软件中光谱相似度矩阵验证其光谱特异性（相似度≤0.95 判定为不同群体），A1 与 B 相似度仅为 0.42，证实二者光谱差异显著（图 3C 和 3D）。验证后的群体（AF-A1、AF-B）纳入光谱解析流程。

图 3. 在未染色的小鼠脾脏细胞样本中识别出独特的自发荧光特征。A. 主要细胞群的光谱密度图。B. A1 和 B 群体的光谱密度图。C. AF A1 和 AF B 的光谱相似性矩阵。D. AF A1 和 AF B 的光谱。

表征自发荧光群体后，对比加入与不加入自发荧光光谱的解析结果。未染色样本（图 4A）、CD8a BV570 单染样本（图 4B）、全染色样本（图 4C）中，不扣除自发荧光会产生杂乱假阳性群体(红色箭头指示)；加入 AF-A1 与 AF-B 光谱可消除这些假阳性群体，获得准确免疫分型结果。全染色样本生物学分析如图 5 所示，可精准识别免疫亚群。

图 4. 8 色小鼠脾脏细胞免疫表型分析 panel 中自发荧光提取的影响。A. 未染色样本的典型图谱。B. CD8aBV570 单染样本。C. 样本在解析过程中包含或不包含自发荧光光谱的对比。

图 5. 消除自发荧光的小鼠脾脏细胞表型分析示例。通过连续设门来识别以下细胞群：B 细胞、NKT 细胞、NK 细胞、CD8a+ T 细胞、CD4+ T 细胞和髓样细胞。

未染色的小鼠肺细胞样本自发荧光信号高度异质且信号较强，无法从 FSC/BSSC 图区分单个细胞群。为识别所有不同自发荧光特征群体，从 FSC/SSC 圈选所有目标细胞为主群，主群光谱密度图显示在 UV/V 通道存在峰值自发荧光信号（图 6A）。利用自发荧光信号强或异质的通道区分自发荧光群体，通过 UV784/UV424 密度图识别出 4 个群体（A–D），在其他通道分层圈门确保每个门内自发荧光均一（图 6B）。通过光谱相似度（≤0.95）筛选，保留相似簇中信号强度最高的群体（图 6C），最终解析时纳入 4 条独特自发荧光光谱（A2、B1、B3、C1，图 6D）。

图 6. 从未染色的小鼠肺细胞样本中识别出独特的自发荧光特征。A. 主要群体的光谱密度图。B. 在不同通道中使用分层门控来识别具有均匀自发荧光特征的群体。C. 通过相似矩阵过滤自发荧光光谱，从 9 个光谱（左）减少到4个光谱（右）。D. AF A2、AF B1、AF B3 和 AF C1 的光谱特征。

识别 4 条自发荧光光谱后，验证单染样本解析结果准确，再将光谱矩阵应用于全染色样本。对比扣除与不扣除自发荧光的解析结果如图 7 所示：未染色（图 7A）、CD24 BV421 单染（图 7B）、全染色样本（图 7C）中，不扣除自发荧光会产生杂乱假阳性群体（用青色表示）。加入 4 条自发荧光光谱可消除假阳性群体，提高免疫分型准确性。全染色样本生物学分析如图 8 所示，可精准区分免疫亚群。

图 7. 14 色小鼠肺细胞免疫分型 panel 进行自发荧光提取的效果。A. 未染色样本的典型图。B. CD24 BV510 单染样本。C. 包含或不包含自发荧光光谱的全染样本 。

图 8. 通过消除自发荧光实现小鼠肺细胞表型分析的示例。应用层级门控来识别以下细胞群体：(1) 内皮细胞；(2) II 型上皮细胞；(3) 肺泡巨噬细胞；(4) 中性粒细胞；(5) 嗜酸性粒细胞；(6) CD11b+ 树突状细胞；(7) CD103+ 树突状细胞；(8) Ly6C- 单核/巨噬细胞；(9) Ly6C+ 单核/巨噬细胞；(10) Ly6C++ 单核/巨噬细胞；(11) 间质巨噬细胞。

自发荧光高异质样本中，从单染样本准确计算所有荧光素光谱具有挑战性。如图 9A 所示，简单用阳性群体信号减去阴性群体信号后，CD24 BV510 单染样本光谱解析结果并不准确。利用 CD24 BV510 单染样本主群体的光谱密度图（图 9B）计算 BV510 光谱时，可以看到在 UV424 到 UV661 通道范围内存在信号强度不同的细胞群体，但这些群体并不对应于阴性或阳性群体。这是该群体自发荧光异质性的结果。通过将阴性信号从阳性信号中相减计算得到的参考光谱，实际上包含了阴性与阳性群体自发荧光信号的差异。

此时需识别自发荧光强度均一的阴、阳性群体。选择自发荧光信号强、特征明显且无特异性荧光素信号的通道，有助于识别自发荧光一致的群体。如图 9C 所示，通过 UV757/UV424 密度图识别自发荧光强度均一的 E12 群体，在 E12 门内圈选阴、阳性群体，确保二者自发荧光强度一致，提升 BV510 光谱计算准确性。使用校正后光谱的解析结果如图 9D 所示。

图 9. 在 CD24 BV510 单染小鼠肺样本中，通过统一的自发荧光强度识别阴性和阳性群体：A. 解析的 CD24 BV510 单染样本数据，使用简单计算得到的不太准确的光谱。B. 在 CD24 BV510 单染样本的主群体中，阳性和阴性群体的光谱密度图。C. 识别具有相同自发荧光信号的阳性和阴性群体。D. 使用基于具有相同自发荧光信号的阳性和阴性群体的修正光谱计算，对 CD24 BV510 单染样本进行光谱解析的结果。

更复杂情况下，部分单染样本仅存在阳性群体而无对应阴性群体，需更精细方法：在未染色样本中识别与阳性群体自发荧光强度均一的阴性群体。此类复杂案例建议用补偿微球制备单染样本。

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