应用前沿 | 基于假病毒构建的低成本自动化中和抗体筛选方案

2025 年 12 月 18 日，中国医学科学院医学生物学研究所王佑春/马磊/易力团队与山东大学公共卫生学院、山东省疾病预防控制中心张丽团队在《MedComm》发表了题为“A Pseudovirus-Based Method for the Simultaneous Quantitation of Neutralization Antibodies Against All Three Poliovirus Serotypes”的论文。该研究成功研发出一种基于假病毒的同时定量检测脊髓灰质炎病毒三种型别中和抗体的方法（PBNA），该方法具备高通量、低成本、自动化、生物安全要求等级低等显著优势，能够满足全球脊灰根除最后阶段对大规模人群免疫水平监测及新型疫苗评价的迫切需求。

使用 P1 质粒、复制子质粒和 T7 RNA 聚合酶质粒用于共转染，以包装脊髓灰质炎假病毒；P1 编码区是含有主要抗原决定簇的蛋白编码区，复制子质粒携带不同荧光报告基因，作者选择了三种荧光报告基因，分别是 eGFP、RFP 和 E2；作者构建了 1 型、2 型、3 型假病毒，每种亚型各四株，同时每种亚型的每株假病毒，分构建了携带 eGFP、RFP 或 E2 荧光基因的假病毒，共计 36 株。将制备好的假病毒和细胞悬液混合，培养 12 小时后，使用 Cytation5（BioTek） 定量荧光斑点的数量，然后采用 Reed-Muench 法计算滴度。当脊髓灰质炎病毒血清型  1、2 和 3 分别对应 E2、eGFP 和 RFP 时，阳性细胞数较高。 因此，脊髓灰质炎病毒血清型 1、2 和 3 的最佳荧光蛋白报告基因被确定为：1 型-E2，2 型-eGFP，以及 3 型-RFP。

作者后续优化了包装质粒的比例，三种质粒的转染比例为 3:3:1 时，阳性细胞数量最多。以及用于中和抗体检测的敏感细胞系 HEK 293T 细胞。

图 1 (A) 三质粒假病毒系统的示意图及假病毒的制备流程。通过将三种质粒共转染至包装细胞中，从而获得假病毒。其中，P1 质粒编码源自特定脊髓灰质炎病毒株的特异性衣壳蛋白；复制子质粒作为通用骨架，提供非结构蛋白及荧光报告基因；T7 RNA  聚合酶质粒则驱动复制子的转录。(B) 针对不同血清型脊髓灰质炎病毒假病毒，对荧光蛋白报告基因选择进行的优化。利用含有三种不同荧光蛋白基因（eGFP、RFP 和 E2）的复制子质粒，分别制备了对应于 1、2、3 型各四种毒株的假病毒，共计涵盖 12 种毒株及 36 种组合。下图：Cytation5 高通量筛选系统

为了建立一种高通量检测脊髓灰质炎病毒中和抗体的方法， 研究人员优化了检测时间、细胞掺入量和假病毒掺入量等参数，研究人员检测了 HEK 293T 细胞感染 Sabin2-eGFP 假病毒后不同时间点的阳性细胞数量。确认最佳检测时间为感染后 12 小时。随后为了确定敏感细胞 HEK 293T 的最佳数量，使用假病毒免疫后的鼠血清进行 PBNA 检测，4 × 10⁴ 个细胞/孔时观察到最高相关系数 (R² = 0.9942)，于是确定最佳细胞数量 4 × 10⁴。为了优化中和试验中假病毒的感染条件，研究团队继续使用假病毒免疫后的鼠血清和不同剂量的病毒进行 PBNA 检测，在 1500 TCID50/mL 时相关系数最高 (R² = 0.9947)，因此选择该剂量作为最佳病毒颗粒剂量。

血清样本灭活并进行系列稀释后，和假病毒加入到 96 孔板中，加入HEK 293T 细胞后培养 12 小时，使用 Cytation5 成像系统对 96 板进行成像并统计斑点数量。研究团队进一步集成了 BioTek Cytation5 高通量成像和 BioStack 4 机械臂叠板架，优化了自动化工作流程。优化后的系统可以实现数分钟内处理每个 96 孔板的稳定循环时间，涵盖了自动上样、三通道荧光成像和数据导出。这使得单台仪器能够在标准的 8 小时日常运行时间内处理 48 个孔板。

研究团队后续测试了 PBNA 特异性和重复性，均表现良好。

图2  (A) 最佳中和抗体检测时间的筛选。在假病毒感染 HEK 293T 细胞后的不同时间点（6、12、16、20、24、36 和 72 小时），测定 eGFP 阳性细胞的数量。Y 轴表示 eGFP 阳性荧光斑点的数量。B) PBNA 最佳敏感细胞接种量的筛选。通过计算 ED50 及其相应的 R2 值，评估了 5 × 10³ 至 1.6 × 10⁵ 个细胞/孔的细胞接种量对中和试验的影响。(C) PBNA 最佳假病毒剂量的筛选。通过计算 ED50 及其相应的 R2 值，评估了 150 ~ 40,000 TCID50/ml 范围内不同假病毒剂量对中和试验的影响。下图：Cytation&BioStack 自动化筛选工作站

为了进一步评估基于三色荧光法的脊髓灰质炎病毒 PBNA 的可靠性，研究团队将计算的中和抗体滴度与金标准 cNT 检测的 1、2 和 3 型脊髓灰质炎病毒的滴度进行了比较，结果显示，动物血清中 PBNA 和 cNT 检测结果在 Sabin 1、2 和 3 型之间均呈现强相关性，而且 PBNA 法 Sabin 1、2 和 3 型血清型的 ED50 值均高于 cNT 法，说明 PBNA 法检测中和抗体效率可能更高。后续研究人员进行了多物种及临床血清样本验证，结果良好。

图3  （A) PBNA 与 cNT 之间的相关性分析。利用 PBNA 和 cNT 方法，分别对 42 份经 Sabin-IPV 免疫的三价混合血清（兔血清 n = 15；大鼠血清 n = 27）进行了针对 Sabin 1、2 和 3 型病毒的中和抗体检测；随后，对上述两种检测方法测得的 Sabin 1、2 和 3 型病毒的 ED50 值进行了 Spearman 相关性分析。对于低于检测限的数值，在进行统计分析时统一赋值为该检测限的一半。图中实线代表趋势线；r 值表示两种检测方法之间的相关性；p < 0.0001 表示检测结果具有显著差异。(B) PBNA 与 cNT 之间 ED50 值的倍数差异。纵轴表示 Sabin 1、2 和 3 型病毒在 PBNA 与 cNT 检测中所得 ED50 值的比率。横线表示不同血清型 ED50 值倍数差异的几何平均值。

参考文献：

Liu M, Yu Y, Li Y, et al. A Pseudovirus‐Based Method for the Simultaneous Quantitation of Neutralization Antibodies Against All Three Poliovirus Serotypes[J]. MedComm, 2025, 6(12): e70551.

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