5分钟get基因编辑靶点设计方法：想要事半功倍，这4点很重要

① 敲除：选择关键结构域编码序列上游，最好位于第一或第二外显子上，这样可以保证蛋白尽可能多的功能域失效。

② 敲低：靶向启动子区的顺式作用元件，或5''UTR、内含子剪接位点。

③ 单碱基替换：对需要改变的密码子精准编辑，需判断是否存在旁系同源序列干扰。

④ 大片段删除：在目标区域两侧设计双靶点，需考虑染色体结构稳定性。

拿到候选基因序列后，一定要在参考基因组里做一下Blast。

如果你的靶标序列（包括PAM区）在基因组里有高度相似的同源序列，大概率会发生脱靶，可设计保守结构域靶点敲除整个家族，或选择特异区段逐一敲除。

此外还需要查看所有转录本，确认基因结构。优先选择所有转录本的公共区域，以免可变剪接导致编辑无效。

以CRISPR/Cas9为例，

如果基因比较特殊，能用的靶点很少，或者你对单靶点的效率不放心，最稳妥的办法是针对同一个基因设计两个靶点。切除中间的大片段，这种突变类型在后期做PCR分子检测时也更容易鉴定。