髓鞘，是包裹在神经纤维外的多层脂质膜结构，占干重的 70%–80% 都是脂质，负责神经信号高速传导，它的合成、更新与损伤，直接关联多发性硬化等脱髓鞘疾病。但想在完整组织里看清 “氘标记分子去了哪、掺了多少”，长期是结构生物学与脂质组学的难题。

发表在《Current Research in Structural Biology》的一项研究，用体内氘代谢标记 + 中子衍射 + 质谱的组合拳，首次在 intact 小鼠神经髓鞘中，实现了氘标记的精确定位与定量，还靠一款关键软件 ——MassWorks，把复杂同位素峰形算得明明白白。

1 引言

髓鞘膜及其分子组分的衍射研究，揭示了支撑髓鞘稳定与失稳的分子组织形式。髓鞘对神经快速高效传导至关重要，其脱髓鞘改变与多种神经系统疾病相关。作为多层膜堆叠结构，层状衍射可清晰提供膜内脂质、蛋白与水的分布信息，以及特定脂质与蛋白的定位信息。

多数髓鞘衍射研究使用 X 射线，而中子衍射具有独特优势：氢（H）与氘（²H/D）的散射长度差异显著，可实现氘的精准定位。氘定位可通过氘交换与氘标记实现：H→D 交换可直接测定多层髓鞘水室中 H₂O/D₂O 的分布与交换动力学，明确疏水结构域厚度；非共价氘标记可通过扩散氘代化合物实现定位，共价标记则可通过引入氘代髓鞘组分或前体实现。

与特异性前体标记需通过血 - 神经屏障 / 血 - 脑屏障不同，重水（D₂O）饮水可实现全身分子组分的非特异性代谢标记。本研究从孕鼠开始给予 D₂O 饮水，持续至产后两个月，对比 H₂O/D₂O 喂养母鼠（H - 母鼠、D - 母鼠）与幼鼠（H - 幼鼠、D - 幼鼠）的坐骨神经与脊髓衍射结果。中子散射密度剖面显示膜双分子层中心散射密度显著升高，与脂质烃链氘代一致；质谱验证了氘代脂质的种类与丰度差异，证实该方法可区分髓鞘快速合成的从头脂生成与成熟髓鞘的靶向脂质周转。

2 材料与方法

2.1 试剂与标准品

甲基叔丁基醚（MTBE）、氯仿购自 Sigma-Aldrich；甲醇购自 Fisher；乙酸铵购自 Fluka；99.9% D₂O 购自 Sigma-Aldrich 与 Eurisotop。

2.2 实验动物

C57BL/6 孕鼠饲养于波士顿学院动物中心，12 小时光暗循环，自由摄食饮水。妊娠第 12 天开始分组：处理组饮用 15% D₂O 水，对照组饮用普通水；幼鼠 7 日龄 D₂O 浓度升至 20%，13 日龄升至 30%；28 日龄断奶，持续 30% D₂O 至幼鼠 55 日龄，母鼠约 131 日龄时统一处死。所用 D₂O 浓度低于小鼠毒性阈值。

2.3 样本制备

CO₂窒息处死小鼠后断头，取大脑（含视神经）、三叉神经速冻，-80℃保存用于质谱；取坐骨神经、脊髓用于中子衍射。坐骨神经两端结扎，轻拉固定于支架；脊髓平铺于滤纸。样本经 1% 多聚甲醛 + 1.5% 戊二醛（0.12 M PBS，pH 7.4）室温固定过夜，再经不同 D₂O 比例（0–100%）的 PBS 平衡过夜，装入石英毛细管密封，室温保存待测。

2.4 中子衍射

实验在法国劳厄 - 朗之万研究所（ILL）D16 谱仪完成。单色中子束波长 4.55 Å，经高定向热解石墨聚焦，两对准直缝优化照明与角分辨率，样本处束斑尺寸 1 mm（水平）×10 mm（垂直）。单色器 - 样本距 2980 mm，样本 - 探测器距 955 mm，采用 MiLAND 大面积中子探测器，采集 2θ=4°–14.6° 衍射信号。

所有实验在室温常压下完成，曝光时间 1–3 小时。数据经 ILL 自研软件 LAMP 处理：

1. 归一化入射中子束通量；
2. 以水的非相干信号校正探测器效率与立体角；
3. 校正样本衰减；
4. 扣除空管与仪器背景，归一化样本厚度；
5. 沿神经轴垂直积分，得到一维衍射图谱。

使用 MagicPlot 确定峰位、峰宽与积分强度，按公式计算髓鞘周期（d）、散射矢量（q）、结构振幅（F (h)），经线性回归与相位校正，计算中子散射密度剖面。

3 质谱分析

3.1 匀浆与脂质提取

三叉神经在冰上用 0.1% 乙酸铵匀浆，取 50 μL 匀浆液加入 375 μL 甲醇涡旋，再加入 1.25 mL MTBE 室温孵育 1 小时，加入 312.5 μL 超纯水诱导相分离，室温静置 10 分钟后 1000 g 离心 10 分钟。收集上层有机相，真空离心干燥，-20℃保存备用。

3.2 高效薄层色谱（HPTLC）

采用 HPTLC 分析极性与中性脂质：极性脂质展开体系为乙酸甲酯 / 正丙醇 / 氯仿 / 甲醇 / 0.25% KCl / 乙酸（25:25:25:10:9:0.3）；中性脂质先经氯仿 / 甲醇 / 乙酸（93.1:1.9:0.1）分离至 8 cm，再经己烷 / 乙醚 / 乙酸（89.3:5.7:0.1）分离至顶端。10% 硫酸铜 + 8% 磷酸染色，160℃加热 13 分钟显影。

3.3 液相色谱 - 质谱（LC-MS）

脂质提取物复溶于甲醇 / 氯仿（1:1），取 150 μL 真空干燥，再用流动相复溶。采用 CORTECS™ C₁₈柱分离，Agilent 6220 质谱仪正负离子模式检测，m/z 范围 100–3000，干燥气温度 325℃，流速 8 L/min，雾化压力 45 psig，毛细管电压 4000 V。

使用MassWorks 软件进行谱图准确度校正，区分天然同位素与氘代信号，自动识别单同位素峰（M₀）与氘代同位素体（M₁–Mₙ），计算氘代百分比（含≥1 个氘的脂质比例）与加权平均氘原子数。脂质鉴定基于 LIPID MAPS、SwissLipids 数据库及小鼠神经组织文献。

图：小鼠三叉神经分离脂质的质谱检测结果。每组竖向排列的 4 张质谱图（或称图组）分别对应一种不同脂质，从上至下依次为：母鼠氢代组（H-dam）、幼鼠氢代组（H-pup）、母鼠氘代组（D-dam）、幼鼠氘代组（D-pup）的质荷比（m/z）- 相对丰度质谱同位素分布曲线。非氘代样本的质谱峰对应天然丰度同位素；氘代样本中，质荷比（m/z）依次升高的一系列质谱峰，对应氘（D）掺入程度逐级增加。所有图组按照母鼠氘代样本（D-dam）的氘化程度分为三类：第 1 组：高氘化（蓝色框标注）；第 2 组：中等氘化（紫色框标注）；第 3 组：低氘化（胆汁绿 / 橄榄绿框标注）。各组图组内，脂质种类相同但质荷比不同的脂质被方框圈出，方框采用专属线型区分（详见图例），方框左上角以缩写形式标注对应脂质名称。

4 结果与讨论

4.1 固定组织用于衍射的可行性

为保证样本运输过程中的结构完整性，本研究采用醛类固定。既往 X 射线衍射证实，固定仅轻微改变髓鞘周期、膜堆积与电子密度分布，可保留不同髓鞘的内在结构差异。固定后髓鞘周期从 175.3 Å 增至 186.1 Å，布拉格峰位与强度变化源于胞间隙缩窄、胞外间隙增宽，但氘代谢标记样本仅峰强度改变、周期不变，证实氘稳定掺入膜结构。

4.2 膜散射密度的系统性变化：与脂质氘代一致

散射密度剖面显示：H - 幼鼠与 H - 母鼠在 0%/100% D₂O-PBS 下散射密度高度重合；D - 幼鼠与 D - 母鼠峰位一致，但幼鼠膜双分子层中心散射密度显著更高，与孕期与发育期髓鞘大量从头合成一致。

对比氘标记组与对照组：母鼠仅中心烃链层轻微升高，提示成熟髓鞘稳态下的脂质周转；幼鼠膜双分子层中心大幅升高，且在所有对比度条件下均一致，明确氘集中于富氢脂质烃链区域。髓鞘蛋白占比低、分布更广，难以在氘代脂质背景下被检出。

4.3 小鼠组织脂质的代谢氘代

既往研究证实 D₂O 饮水可用于小鼠脂质周转研究，但均未覆盖髓鞘最快速合成阶段。本研究从孕鼠开始标记，同时分析母鼠与幼鼠，首次区分髓鞘发育合成与成熟维持的脂质代谢差异。

4.4 质谱验证脂质氘代，母鼠氘代水平差异显著

对照组仅存在天然同位素丰度，天然氘水平约 0.19%，与无标记无统计学差异；D - 幼鼠与 D - 母鼠单同位素峰强度下降，氘代同位素体信号显著增强。

MassWorks 软件精准解析：

• 幼鼠脂质平均氘代率97.6%±2.0%，所有脂质均呈对称钟形分布，平均氘数 4–9 个；
• 母鼠平均氘代率60.6%±26.4%，分布复杂，不同脂质差异极大：
• 高氘代（>90%）：PC 部分亚型、PI、DG；
• 中氘代（60%–90%）：PE 部分亚型、PC、PS；
• 低氘代（10%–60%）：SHexCer、TG、SM、PE、FA、HexCer。

该结果与既往示踪研究一致：PI、PC 周转最快，PE 次之，HexCer、SHexCer 较慢，SM 最慢，且首次揭示同一脂质不同亚类的代谢差异。氘掺入途径包括糖酵解 / 甘油生成过程中氘转移至甘油骨架，以及脂肪酸合成中酶促掺入。

图：氘代母鼠（D-dam）与氘代幼鼠（D-pups）脂质氘化水平对比本结果。基于正负离子模式下脂质的质谱检测数据，采用 MassWorks 软件（Cerno Bioscience 公司）分析。本研究通过 MS-LAMP 方法（Sabareesh & Singh, 2013）共鉴定 89 个实验单同位素峰；其中纵坐标所示 27 个单同位素峰，其质荷比（m/z）已被确认为小鼠 / 大鼠神经组织及专业整理数据库中的特异性脂质种类（详见材料与方法部分引用文献）。针对每个单同位素质荷比，图中展示了氘化百分比（由各氘同位素异构体相对丰度百分比求和计算得出）：红色代表母鼠（D-dam），蓝色代表其两只子代幼鼠（D-pups）。对应上述质荷比共鉴定出 7 类脂质及 3 类酰基甘油，具体分组如下：磷脂酰乙醇胺 PE（6 组数据）、磷脂酰胆碱 PC（7 组）、磷脂酰丝氨酸 PS（2 组）、己糖神经酰胺 HexCer（2 组）、磺化己糖神经酰胺 SHexCer（3 组）、神经鞘磷脂 SM（2 组）、磷脂酰肌醇 PI（1 组，含 1 次技术重复）；酰基甘油类：甘油三酯 TG（1 组）、甘油二酯 DG（1 组）、脂肪酸 FA（1 组）。空心圆代表负离子模式检测结果，实心圆代表正离子模式检测结果。

5 结论

• 中子衍射可在完整组织中定位体内代谢掺入的氘；
• 孕期与成熟后氘代谢标记，可区分髓鞘形成与维持阶段的脂质合成与周转；
• 该方法可拓展至正常 / 病理状态下髓鞘脂质的全生命周期调控研究。

6 未来展望

本方法为结构 - 代谢联合研究提供范式：D₂O 全身标记 + 中子衍射定位 + 质谱定量，可应用于肌肉、视网膜、胶原等有序组织，以及髓鞘蛋白、血红蛋白、β- 淀粉样蛋白等分子的动态研究。针对髓鞘，可进一步探索：

• 母鼠 PC 亚型差异氘代的功能意义；
• 成熟后脂质周转速率的年龄依赖性变化；
• 突变与疾病状态下脂质周转的改变；
• 低氘代脂质（SHexCer、TG、SM）定位于膜外层，高氘代脂质（PC、PI、DG）定位于膜内层的分子机制。

该整合策略将推动髓鞘组学的发展，为健康与疾病状态下的结构 - 功能 - 代谢关联研究提供全新工具。

MassWorks软件是由 Cerno Bioscience 公司开发的一款革命性的MS数据定性分析软件，能帮助我们在低分辨率的四极杆GC/MS、LC/MS直接测定化合物的精确质量，并通过独有的谱图准确度概念确定出准确的分子式。MassWorks软件同样适用于高分率质谱（TOF、Orbitrap）的定性分析。

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