07-系统优化冻干工艺，实现mRNA-LNP疫苗4℃下长达一年的稳定储存

今天，我们聚焦一篇发表于《International Journal of Molecular Sciences》的重磅研究，由西班牙CerTest Biotec生物技术公司的Juan Martínez-Oliván与Diego de Miguel团队带来的：“Comprehensive Optimization of a Freeze-Drying Process Achieving Enhanced Long-Term Stability and In Vivo Performance of Lyophilized mRNA-LNPs”。

在mRNA疫苗大放异彩的今天，其极度娇贵的“体质”要求极其苛刻的超低温冷链运输（如-80℃或-20℃），这成为了制约mRNA疗法向全球特别是欠发达地区普及的最大“卡脖子”痛点。为了攻克这一难题，该研究团队没有局限于寻找新型脂质，而是另辟蹊径，系统性地深度优化了mRNA-LNP（脂质纳米颗粒）的冻干配方（缓冲液与保护剂）及关键工艺参数。 突破性的结果表明：经过优化后的冻干mRNA-LNP，在常规冷藏（4℃）条件下，其理化特性与体内生物活性稳定保持了长达一年（60周）之久，且在室温（25℃）下也能维持长达4周的强效活性。这项工作为彻底打破mRNA疫苗的极低温存储魔咒、大幅削减物流成本提供了极具临床转化价值的完美答卷。

要想让LNP在脱水和冷冻的极端应激下“活下来”并保持原样，极其考验配方与工艺的精准度。研究团队顺藤摸瓜，从配方筛选到工艺打磨，再到长效验证，向我们展示了这一硬核技术的全貌。

图1. 配方之争：Tris缓冲液完胜PBS，奠定冻干基本盘

要进行冻干，首先得给LNP找一个舒适的“液体摇篮”。研究人员对比了两种最常用的缓冲液：PBS和5 mM Tris，并搭配了经典的冻干保护剂（蔗糖或麦芽糖）。结果出现了一边倒的局势： 当使用PBS缓冲液时，冻干后的LNP出现了明显的“水土不服”——mRNA包封率显著下降（跌破80%），颗粒尺寸大幅膨胀，且表面带负电的Zeta电位增加（暗示带有负电荷的mRNA从破裂的LNP中泄漏了出来）。反映在细胞实验中，PBS组的转染效率大打折扣。 相反，Tris缓冲液展现出了惊人的护航能力。它极大地稳定了LNP的尺寸和包封率，体外转染效率更是远超PBS组。这背后的核心机制在于：PBS在冷冻过程中容易因为钠离子的存在导致剧烈的pH值偏移，从而破坏LNP结构；而Tris不仅能更好地维持pH稳定，还能减少导致mRNA-脂质加合物形成的氧化反应。第一回合，Tris脱颖而出。

图2. 工艺进化：精雕细琢冻干参数，全面提升LNP存活率

找到了好配方，还要有精湛的“厨艺”。在最初的冻干配方中，研究人员发现主干燥阶段结束时仍有残余水分，这会导致LNP在后续阶段受损。 为此，团队对冻干程序进行了精准的工艺升级：延长了初级干燥的时间，以确保冰晶中的游离水被彻底升华抽干；同时，为了让环境更温和，将初级干燥温度设定为-15℃，次级干燥温度设定为30℃。 奇迹出现了：经过优化工艺冻干的LNP，不仅mRNA流失量大幅减少（包封率显著提升），而且在小鼠体内的蛋白表达水平（荧光亮度）全面超越了初始工艺。经过综合比对，研究人员最终敲定了“Tris缓冲液 + 20%麦芽糖 + 优化冻干程序”的最强王者组合，准备迎接接下来的“岁月大考”。

图3. 岁月大考：60周理化性质追踪，4℃下坚如磐石

一款合格的疫苗不仅要刚做出来时有效，更要经得起时间的考验。研究团队进行了一项长达1年（60周）的极限稳定性马拉松。他们将优化后的冻干LNP分别储存在4℃（常规冷藏）、25℃（室温）和37℃（高温）下，并与传统的-80℃冷冻保存的LNP进行对比。 理化数据令人振奋：在4℃储存了60周的冻干LNP，其颗粒大小、多分散性（PDI）、Zeta电位以及总mRNA浓度几乎一条直线，没有发生显著变化！更关键的是，其内部mRNA的完整性与-80℃冷藏组不相上下。 有趣的是，通过冷冻电子显微镜（Cryo-TEM）观察，研究人员发现冻干过程会让LNP表面产生一些特殊的“水泡状”（bleb）结构。但这并非坏事，此前的研究表明这种结构反而有助于促进细胞内体的逃逸，提高转染效率。

图4. 终极验证：体内表达火力全开，常规冰箱即可护航

数据好不好，最终要在动物体内见分晓。研究团队将这些储存了不同时间的LNP注射到小鼠肌肉中，观察荧光素酶的表达情况。 体内生物发光图像给出了一锤定音的结论：在4℃常规冰箱中睡了一整年（60周）的冻干mRNA-LNP，注射进小鼠体内后依然火力全开，其蛋白表达效果与一直待在-80℃超低温冰柜里的LNP完全一样（见图4C、D图中的蓝线与黑线高度重合）。 不仅如此，即使是在25℃室温下，这款冻干LNP也能在前4周内保持近乎100%的体内活性。这意味着，在未来的疫苗分发中，即使出现短暂的冷链断裂或必须在室温下运输到偏远村庄，疫苗的有效性依然能够得到保障。

这项研究没有在复杂的化学合成上做文章，而是回归了制剂学的本质，为我们带来了三层极其深刻的思考：

核心科学思想： 很多时候，我们过于迷信通过开发全新结构的阳离子脂质来提升LNP的性能。但本文告诉我们，递送载体的成败往往存在于“木桶效应”中。缓冲液的选择（Tris带来的酸碱缓冲和抗氧化加持）以及冻干工艺中温标和时间的微调，其对最终成药稳定性的贡献，丝毫不亚于底层分子的创新。

背景与横向对比： 回顾历史，辉瑞/BioNTech的Comirnaty疫苗在2021年进行过一次重大升级——正是将原有的PBS缓冲液替换为Tris缓冲液，这让疫苗能在常规冰箱内存放的时间从几天延长到了两周。而本文在此基础之上，引入并彻底打磨了冻干技术，直接将4℃下的保质期从两周跨越式地拉长到了一年。相比于印度已获批的GEMCOVAC-19（一种冻干的脂质复合物Lipoplex疫苗），本文采用的LNP技术平台在均一性和体内递送效率上更为先进和主流。

深刻见解与未来展望：

• 平台化潜力：这套被验证的优化冻干工艺，其意义远不止于疫苗。它可以作为一个平台技术，被广泛应用于其他基于LNP的mRNA疗法，如癌症疫苗、罕见病基因疗法、甚至CRISPR基因编辑药物，解决这些前沿疗法共同面临的稳定性与分发难题。

• 从实验室到工业化：下一步的关键挑战在于将这一实验室规模的优化工艺进行放大，并符合药品生产质量管理规范（GMP）要求，实现大规模工业化生产。这需要对设备、参数进行进一步的验证和适配。

• 探索极限：虽然研究证实了4℃下长达一年的稳定性，但未来的研究可以进一步探索在更高温度（如25℃室温）下的稳定性极限，或开发更为简便快速的冻干方案，进一步降低生产成本和复杂度。

总而言之，这项研究为解决mRNA技术应用的核心瓶颈提供了一把精巧的“钥匙”，通过精湛的制剂工艺优化，让我们离“人人可用”的mRNA药物更近了一步。

Alejo T, Toro-Córdova A, Fernández L, Rivero A, Stoian AM, Pérez L, Navarro V, Martínez-Oliván J, de Miguel D. Comprehensive Optimization of a Freeze-Drying Process Achieving Enhanced Long-Term Stability and In Vivo Performance of Lyophilized mRNA-LNPs. Int J Mol Sci. 2024 Oct 1;25(19):10603. doi: 10.3390/ijms251910603. PMID: 39408932; PMCID: PMC11476828.